流式细胞术的基本原理与应用简介.ppt

1、a,1,流式细胞术的基本原理与应用简介,余琪琪 12-09-2011,a,2,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry）就是对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术,a,3,流式细胞仪工作原理示意图,a,4,流式细胞仪可提供的信息,物理信息：通过散射光信号反映 荧光信息：通过荧光信号反映,a,5,散射光信号的产生,488nm激光产生散射光,SSC,FSC,a,6,前向角散射光信号（FSC,a,7,侧向角散射光信号（SSC,a,8,利用散射光信号对混合细胞分群,红细胞裂解的全血,a,9,荧光信号的产生,a,10,荧光信号的表示方法

2、,双参数点图,单参数直方图,a,11,一个完整的流式实验流程,样品的准备 荧光标记的选择 对照设置 仪器条件的确定 数据分析,a,12,样品准备,血液或骨髓标本 体液、灌洗液、悬浮培养细胞 贴壁细胞 组织标本,单细胞悬液，浓度51051 106/mL,a,13,样本流速的选择,高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 （注：根据制备样本浓度随时调整流速,a,14,荧光标记抗体的选择,尽量使用直标抗体 多色标记时应该增加各种抗体的用量或适当延长反应时间 根据流式细胞仪的类型及荧光素的光谱选择荧光抗体 根据检测物（抗原）

3、表达量选择荧光染料 使用双标以上抗体需要做荧光补偿,a,15,流式细胞仪,型号：BD FACSCanto II 光学信号的产生： 激光（488nm，633nm） 光学信号的收集： 光学滤片 光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号,a,16,FACSCantoII的光学滤片,长通滤片 （Longpass，LP,带通滤片 （Bandpass，BP,LP500,500/50,a,17,750-810nm,650-670nm,FACSCantoII信号检测组件,a,18,常见荧光染料的发射波长,荧光强度：APCPEPE-Cy7FITC 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配

4、搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小,a,19,a,20,对照设置,阴性对照 阳性对照 补偿对照,a,21,阴性对照,空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光域值 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2,a,22,阳性对照,阳性对照：阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性,a,23,补偿对照,补偿对照:多色荧光分析，进行荧光补偿 将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，

5、以测定荧光信号的重叠并做适当调整,a,24,仪器条件的确定,电压 阈值 荧光补偿（多色分析,a,25,电压,PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变,放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log,光信号,光电倍增管（PMT,放大器,电信号,a,26,线性放大（lin,按光强度的线性关系输出信号 （FSC、SSC、细胞周期检测等,a,27,对数放大（log,按光强度的对数关系输出信号，用于大多数荧光染色实验,a,28,阈值（threshhold,屏蔽噪音信号和碎片信号,a,29,荧光补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差,a,30,补偿公式,通

6、常干扰光占该染料所发出荧光总量的X,RD1-X%FITC,a,31,补偿模型,PE-X%FITC,横平竖直,a,32,补偿调整的实验过程,样本准备：阴性样本，单阳性样本 调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿 自动调补偿 手动调补偿,a,33,判断标准：横平竖直,a,34,数据分析,数据显示方式：单参数直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式 设门：在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析,a,35,单参数直方图 双参数点图 二维等高图,密度图 假三维图 三维图,a,36,设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,a,37,流式细胞术的应用,细胞生理学研究（细胞相对大小和颗粒性、胞内