干细胞生物学(博2014)ppt课件

1、干细胞生物学,医学免疫学,2014.10,研究生讲座,Key word: Stem cell,Medline 检索“Stem cell” 共查到文献 202,658篇 Google 搜索“Stem cell” 共搜到相关网页 51,300,000 (截止8AM；2012.5.26,干细胞概述 胚胎干细胞的基础与临床 造血干细胞的基础与临床 干细胞研究的现状与展望,主要内容,一、干细胞概述,干细胞研究背景 早期胚胎发育的一般概念 干细胞基本概念,干细胞研究的背景,国家“十五”重点研究领域(基础) 基因组学、 信息科学、 纳米科学、 生态科学、 地球科学 基因组学 基因组学（genomics) 蛋

2、白质组学（proteomics） 细胞,基因组学 genomics,基 因,蛋白质,细 胞,基因组（genome） 生物的全部基因和染色体组成,是所有遗传信息的总和;人类基因组含3-3.5万个基因 基因组学(genomics) 分析所有基因的结构（人类基因组图）、核苷酸序列、定位、功能（疾病及调控基因）、基因组遗传学语言（遗传指令、遗传语文及其外输的编辑,疾病基因组学 * 决定疾病发生的所有基因 * 基因是多数疾病的主要病因： 单基因病、多基因病、获得性基因病 基因组药物 基因序列数据新的基因全长cDNA真核细胞瞬时表达功能初筛和验证重组基因稳定表达体内外药效分析临床前研究临床验证新药证书 （

3、传统的药物筛选：蛋白功能药物,蛋白质组学（proteomics） （后基因组学）基本概念,蛋白质组（proteome） * 一种细胞内所存在的全部蛋白质. 蛋白质组学 * 在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其翻译、表达、调控的规律. 功能蛋白质组学 * 特定时间、环境和实验条件下活跃表达的蛋白质,细 胞,细胞间相互作用 蛋白的分子识别 细胞间信息传递 细胞生物学作用的机制 蛋白大分子相互作用 细胞内信息传导 干细胞生物学 SC定向分化 特定组织干细胞 特定组织细胞 组织工程 制备特定器官和组织,早期胚胎发育的一般概念,早期胚胎发育的过程 精子与卵子结合 双倍体合子（单细胞） 卵裂（不生长，连续

4、分裂） 形成细胞团（桑椹胚，morula） 囊胚（含囊胚腔、滋养层、内细胞群,细胞分化（cell differentiation） * 细胞后代形态、结构和功能发生差异的过程; * 细胞的分化在高度精密的调控下有序地进行. * 受精卵有分化为各种组织/细胞的潜能 形成完整个体（含200余种不同类型细胞） * 随胚胎发育，高等动物细胞由全能多能单能 * 分化细胞的胞核仍为全能性，含物种全套基因. (克隆动物的理论基础,定义 * 具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的细胞; 能产生表型和基因型均完全相同的子代细胞; 是机体其他细胞的起源细胞。 生物学特点 SC分裂SC（不分化，含细胞分裂的功能蛋白）

5、 分化为功能单一的细胞（含分化蛋白） 分类（按干细胞发育潜能） * 全能(totipotency)细胞(胚胎干细胞) * 多能（pluripotency）细胞 * 单能（monopotency）细胞,干细胞(stem cell)基本概念,Totipotent cell,Pluripotent cell,胚胎干细胞 ICM或原始生殖细胞 各种细胞类型 造血干细胞 骨髓 血液细胞、神经细胞 神经干细胞 脑 神经元、胶质细胞、血细胞 间质干细胞 骨髓 肌肉细胞、骨骼、脂肪细胞,干 细 胞 分 类,干细胞类型 来 源 分化潜力,干细胞分类,全能干细胞(受精卵、胚胎干细胞) 具有自我更新并分化为任何类型

6、组织细胞的能力。 多能干细胞 分化方向已确定的干细胞（如HSC、肝脏干细胞） 分化为特定组织。 定向祖细胞（committed progenitor） * 多能干细胞分化的下游细胞； 分化和自我维持、自我更新能力受限； 干细胞特性仅能维持较短时间,A stem cell (S) gives rise by asymmetric division to a progenitor (P) with a more restricted proliferation potential, which differentiates in response to extrinsic cues. The st

7、em cell phenotype is regulated by reciprocal short- and/or long-range signaling (thick colored arrows,Watt and Hogan, Science 287:1427, 2000,前体细胞(precursor) * 在发育过程中较另一细胞更早期的细胞 （某些情况下泛指干细胞和祖细胞） 组织专一干细胞 * 是特定组织的起源细胞，具发育潜能； * 动物成体多数组织中保留有部分干细胞； 不同组织来源的干细胞可能互相转化,神经干细胞,神经元、胶质细胞,骨髓环境,脑部,血细胞,二、胚 胎 干 细 胞 的

8、基础与临床 embryonic stem cell,ESC,ES细胞概述 ES细胞生物学特征 ES细胞研究进展和应用前景,定义： 从早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(PGC)分离而来的高度未分化细胞（具有发育全能性），可被定向诱导分化为所有种类的细胞，形成（内、中、外三个胚层）复杂的组织、器官、甚至完整的个体,一）ES 细 胞 概 述,二）ES细胞生物学特征 1.具有类似胚胎的分化全能性； * 分化出三胚层分化细胞； * 注入同基因小鼠生成畸胎瘤 2.具有种系传递功能（即发育全能性） * 植入假孕受体鼠子宫可发育成嵌合体胚鼠； 3.可用于遗传操作的最早

9、期细胞 （knock-out、knock-in,ES细胞的建系 * 小鼠ES细胞系的建立(Evens等1998, Science) * 人类ES细胞系的建立(1998)； ES细胞的定向分化 在通过改变培养状态或诱导方式（饲养细胞、分化诱导因子、分化抑制因子等）实现定向分化。 ES在体外已可分化为造血细胞、神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞、内皮细胞、脂肪及血管发生,Derivation of the Human Embryonic Stem Cell Line Inner cell mass-derived cells H9 human ES cell colony H9 cells observ

10、ed with higher magnification Differentiated H9 cells in the absence of the feeder cells (Thomson et al., Science 282:1145, 1998,造 血定 干向 细分 胞化 的,三）ES细胞研究进展与应用前景,研究人或动物发育 在临床医学中的应用 有待解决的问题,借助转基因、基因打靶、基因芯片、基因捕获（trapping）技术，并通过分析/调控ES细胞定向分化的微环境、细胞因子、基质细胞、胞外基质等，研究人与动物胚胎分化发育。 * 寻找决定胚胎细胞定型、分化的关键因素； * 分析特定基

11、因的发育功能； * 寻找发育调控基因； * 体外研究人胚胎发生、发育,ES用于研究人或动物发育,转 基 因 动 物 的 建 立,通过对ES细胞发育及定向分化研究，阐明细胞的增殖、分化、发育、成熟、迁移、定居、衰老、凋亡、癌变等生理或病理过程,ES在临床医学中的应用,1. ES细胞用于药理学研究 ES细胞具有分化的广谱性，可模拟体内组织和细胞间复杂的相互作用，故可代替整体动物，作为评价新药及化学产品的毒性（致畸）与药效的检测系统。 2. 作为研究人类疾病发生、发展机制的模 型，探讨有效和持久的治疗方法,3. 作为临床细胞、组织、器官移植的最佳来源 * 组织/细胞移植的细胞源 * ES细胞分化、移

12、植取得突破的实例： ES（少突/星状）胶质细胞 治疗髓磷酯疾病 * 克隆技术/组织工程 开拓移植物来源新途径。 取人多脏器特异性SC 与三胚层形成期动物胚胎进行嵌合 使新生动物具有人的某一个或几个脏器,4。基因治疗的细胞源 * 修饰ES细胞基因 矫正缺陷基因,如何使特定个体的体细胞变为ES细胞,1治疗性克隆（therapeutic cloning）：用成人细胞核取代卵细胞核，在体外培养至囊胚期，然后从囊胚的内细胞层获得ESC，但不再植入子宫，即不会发育成胚胎； 2组织移植：用动物卵细胞作为人细胞核受体，培育后获得ESC； 3 细胞杂交：融合人细胞核与ESC胞质,Fuchs and Segre,

13、 Cell 100:143, 2000,1。技术上的难度 * 成熟干细胞含量极微，分离和纯化困难，且数量随年龄增长而降低； * 迄今未能从肺、胰腺、肾脏和成熟心脏等器官分离出干细胞； * 对某些急性病，无足够时间进行培养； * ES极易分化为其他细胞； * 体外将ES细胞发育为器官（即组织工程）的技术难度,干细胞临床应用的限制因素,2理论上的不确定性 * 人ESC能否被强制定向分化； * 能否让培养中的所有ESC均按人们意愿同步分化； * ESC的中间细胞类型，如何界定、检测（特征性表面标志）和分离； * ESC分化的微环境，触发和控制细胞分化的条件和确切机制； * 通过体外扩增以获得足量细胞

14、时，如何保留ESC自我维持而不分化的特点,3安全性 （1）遗传缺陷病的遗传错误、或理、化、生物因素或基因突变造成DNA错误复制，其出现于供者干细胞中 成熟干细胞可能含异常DNA。 （2）核移植后的卵细胞可能产生的副作用 * 沉默基因激活、启动某些DNA表达、改变染色体结构等。 （3）ES细胞移植可能形成畸胎瘤的倾向。 * ESC具有全能分化性，故在同一条件下可分化为不同组织类型细胞畸胎瘤） * 对策：在ESC中设自杀基因，必要时启动,Teratomas Formed by the Human ES Cells in SCID Mice Gut-like structure Rossettes

15、fo neural epithelium Bone Cartilage Striated muscle Fetal glomeruli-like structure (Thomson et al., Science 282:1145, 1998,干细胞与癌症发生 * 某些干细胞可能是癌症之源：致癌基因突变的积累是癌症发生的必要条件，干细胞具有近乎无限的自我更新能力，成为积累基因突变的主要细胞。 * 造血干细胞和大脑干细胞具有白血病细胞、脑肿瘤细胞相似的某些表面特征。 * 从脑肿瘤中分离出某些类似脑干细胞（同时具有癌细胞特征）的细胞；这些变异的干细胞可在培养皿中转化为类似原发肿瘤的组织 * 迄今

16、抗癌疗法效果欠佳，其原因可能是：放疗与化疗仅杀死快速分裂的肿瘤细胞，但未能消灭数量较少、生长缓慢的癌症干细胞,4. ES细胞作为移植细胞源的组织相容性,对策： * 建立ESC库，提供覆盖主要HLA型别的ESC * 对ESC的MHC进行遗传学修饰（如knock-out），建立普遍适用的“万能”供者细胞系（donor line）； * 借助同源重组技术，将受者MHC导入ESC； * 直接将受者MHC转入ESC,5伦理学障碍 * 人的胚胎是否享有人的权利？ * 将胚胎细胞用于科研和临床是否符合道德？ 医学伦理原则： 自主、无害、有利、公平,三、造血干细胞的基础与临床,一）成熟（专能）干细胞概述 （二

17、）HSC生物学特征 （三）HSC的临床应用 （四）造血干细胞库的建立,一）成熟干细胞,1. 来源 2. 发育的异质性,成人不同类型组织可分离出成熟干细胞,造血干细胞：从PBMC、骨髓、脐血分离； 神经干细胞： * 特征：具有分化为神经元细胞、（少突/星型）胶 质细胞潜能；能自我更新；有强分裂能力。 * 来源于发育中的胎脑和成年个体的脑组织。 * 易在体外培养，成为理想的转基因宿主细胞 * NSC分化诱导调控机制研究（2000年重点项目） * 肝脏干细胞：从成年动物胆管周围组织,特定组织成熟干细胞能发育成其它类型细胞。 * 小鼠神经干细胞植入骨髓 多种类型血细胞。 * 大鼠骨髓干细胞 形成肝细胞

18、。 * 哺乳动物造血干细胞样的专能干细胞 皮肤、肝、神经细胞或非造血干细胞,成熟干细胞发育的异质性,二）HSC生物学特征 * 造血干细胞(hemopoietic stem cell，HSC)： 具有高度自我更新能力和多能分化潜能的造血前体细胞。 来源：人胚胎期卵黄囊（第2周）、胚肝（第4周）、骨髓（5个月）；出生后骨髓为HSC主要来源； 成年人HSC分布：红骨髓（为主，比例为1/104）、脾脏（1/105）、淋巴结、外周血（0.2/105）脐带血（1/105,造血微环境：造血干细胞分化发育的必要条件： * 激素、细胞因子 骨髓基质细胞分泌的IL-7：B细胞分化和成熟的关键细胞因子； 集落刺激因

19、子：可刺激不同谱系、不同发育阶段细胞的生长和分化； * 骨髓基质细胞表面黏附分子与细胞外基质相互作用 为干细胞及其分化的血细胞提供必要刺激信号； * 骨髓基质细胞表达MHC-I类和II类分子 参与HSC的阳性选择和阴性选择,1自我更新（self-renewal） 造血干细胞 不对称有丝分裂 子代细胞1（早期祖细胞）：继续分化 子代细胞2（自我更新）： （维持造血干细胞的全部生物学特征： 维持干细胞池大小、干细胞数量/质量不变。,2多向分化 * 造血干细胞早期祖细胞 对称性有丝分裂多向分化 3静止性 * HSC具有巨大的功能储备，多数HSC处于静止状态，在机体必需时进入细胞周期。 4不均一性（异

20、质性） 5表面标志 * CD34+、CD38、HLA-DR、CD45RA、c-kit（干细胞生长因子受体）、CD71等,LT-HSC: long-term stem cells ST-HSC: short-term stem cells MPP:multipotent progenitors CLP: common lymphocyte progenitors,三）HSC与临床治疗 1. HSC移植 * 概念：将正常人HSC转输患者 重建造血和免疫功能,1） HSC移植的类型 1）骨髓（HSC）移植 2）外周HSC移植 化疗+细胞因子（如CSF） 动员骨髓HSC至外周血 获得足够数量HSC和祖

21、细胞 用于移植,3）脐血SC移植 * 脐血中含有较高比例HSC和祖细胞（CD34+细胞与骨髓接近，为成人外周血10倍），移植后重建造血持久； * 脐血HSC更原始，端粒较长，死亡受体表达低；体内生命力强； * 脐血细胞HLA表达低(对供、受者HLA相符的要求相对较低)；T细胞较原始，GVHD较低； * 含一定量基质细胞，提供造血细胞生长的微环境 ； *脐血中NK细胞和LAK细胞相对较多，有利于移植物抗白血病反应(GVL)； * 受胎盘屏障保护，被病毒、细菌感染的机会少； *来源丰富、采集过程简单,2）HSC移植的适应症,1）免疫（或造血功能）重建 2）恶性肿瘤化疗/放疗后造血重建,3）自身免疫

22、病（克隆氏病、SLE、IDDM、RA、MS、银屑病、MG、血管炎等）； * MHC、Ig、TCR、BCR、CK、凋亡相关因子和胞浆酪氨酸磷酸酶等基因缺陷可导致多能干细胞在发育成不同谱系免疫细胞时出现功能性改变，从而引起自身免疫病。 * 自身免疫病可视为一种（造血）干细胞病： 依据： HSC移植可治愈AID； HSC移植可将供者的自身免疫病过继给受者,3）造血干细胞库的建立 1骨髓HSC资料库 2脐血细胞库,2HSC的基因治疗 * 有自我更新能力，可在患者体内长期生长并表达外源基因产物； * 具有多向分化能力，分化而成的转基因血细胞可分布全身发挥效应； * 多种疾病与造血细胞异常有关，将缺陷基因导入HSC可缓解症状,1）HSC基因治疗的优点 * 具有自我更新能力，异源基因导入后可在体内长期表达； * 具有向各谱系细胞分化的能力； * 异源基因可通过血循环分布全身,2）适应征 * 要求目的基因能在体内永恒表达发挥作用的疾病（如糖尿病、高血压病、帕金森病、先天性单基因缺陷疾患、某些自身免疫病等）（如转导ADA基因的HSC的过继治疗） * 恶性血液疾病（如白血病） 通过转入调控干细胞分化的基因，保持干细胞自我维持、自我更新的特点，逆转白血病细