表观遗传学课件(2016

1、表观遗传学 （epigenetics,Epigenetic differences：monozygotic twins,遗传类型,1. 遗传编码信息： 提供生命必需蛋白质的模板 2. 表观遗传学信息： 何时、何地、以何种方式去应用遗传信息,遗传信息的传递：中心法则,1. DNA自身通过复制传递遗传信息； 2. DNA转录成RNA； 3. RNA自身能够复制 (RNA病毒)； 4. RNA能够逆转录成DNA； 5. RNA翻译成蛋白质,表观遗传学( epigenetics,1. 概念 基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。 2. 特征 (1)可遗传

2、(2)可逆性 (3)DNA不变,8,8,遗传与表观遗传,9,9,基因组与表观基因组,1942 年沃丁顿 (Wadding ton) 在 Endeavour 杂志 首次提出表观遗传学。 基因型的遗传(heredity)或传承(inheritance)是遗传学研究的主旨 ,而基因型产生表型的过程则是属于表观遗传学研究的范畴,研究历史,1987 年 ,霍利德( Holliday) 进一步指出可在两个层面上研究高等生物的基因属性。 第一个层面是基因的世代间传递的规律 遗传学。 第二个层面是生物从受精卵到成体的发育过程中基因活性变化的模式 表观遗传学,表观遗传学研究 “上代向下代传递的信息 ,可以通过有

3、丝分裂或减数分裂而遗传下去的基因功能的改变，而不是DNA 序列本身” ,这是一种 “不以 DNA序列差别为基础的细胞核遗传”,三个层面调控基因表达： DNA修饰 ：DNA共价结合一个修饰基团，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态。 蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的构象实现对基因表达的调控。 非编码RNA调控：通过某些机制实现对基因转录的调控，如RNA干扰。 意义： 任何一个层面异常，都将影响染色质结构和基因表达，导致复杂综合征、多因素疾病以及癌症。和DNA序列改变不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的，这就为疾病的治疗提供乐观的前景,表观遗传学的研究内容,基因选择性转录表达的调控

4、DNA甲基化 基因印记 组蛋白共价修饰 染色质重塑,基因转录后的调控 基因组中非编码RNA 微小RNA（miRNA） 反义RNA 内含子、核糖开关等,14,表观遗传学机制,DNA 甲基化,1,14,Probst et al. Nat Rev 2009,2021年2月2日,16,一、DNA甲基化,2021年2月2日,DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC,胞嘧啶甲基化反应,16,S-腺苷甲硫氨酸,DNA甲基化

5、转移酶,DNMT1 作为DNA复制复合物的组分，催化子链DNA半甲基化位点甲基化，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性。 DNMT3a和 DNMT3b 主要催化从头甲基化，以非甲基化DNA为模板催化新的甲基化位点形成,基因调控模型,1. DNA甲基化的主要功能：转录沉默 (1) 基因的启动子区域通常不被甲基化修饰 (2) 建立特定的基因表达模式： 组织特异性、生殖特异性 (3) 基因组印记、X染色体失活 2. DNA甲基化抑制基因转录的机制： (1) 干扰转录因子对DNA元件的识别和结合 (2) 将转录因子DNA识别序列转变为阻抑物识别序列 (3) DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子

6、3. DNA甲基化： 是转录沉默的结果和维持，而不是原因,19,一、DNA甲基化,哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%-7%，约70%的5mC存在于CpG二连核苷。 在结构基因的5端调控区域, CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构。 基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合。 DNA甲基化一般与基因沉默相关联； 非甲基化一般与基因的活化相关联； 而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关联,19,2021年2月2日,20,一、

7、DNA甲基化,2021年2月2日,20,5,3,CpG岛主要处于基因5端调控区域。 启动子区域的CpG岛一般是非甲基化状态的，其非甲基化状态对相关基因的转录是必须的。 目前认为基因调控元件（如启动子）的CpG岛中发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关联,Rb基因,CpG 频率,DNA甲基化抑制基因转录的机制,基因启动子区的甲基化可影响转录激活因子和其识别序列的结合，直接抑制基因表达。 甲基化的CpG双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族(MBD)识别，而后者通过吸引组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白甲基化转移酶(HMT)等组蛋白修饰蛋白来改变染

8、色质活性，间接影响基因表达,直接干扰机制 (1,直接干扰机制 (2,间接机制,The methyl-CpG-binding proteins MeCP1 and MeCP2能够与甲基化的DNA结合 MeCP2能够招募Sin3a, HDACs，形成复合物，阻遏转录,MeCP2,Model for methylation-dependent gene silencing. The structural element of chromatin is the nucleosomal core, which consists of a 146-bp DNA sequence wrapped aroun

9、d core histones. Acetylation of the histones causes an open chromatin config-uration that is associated with transcriptional activity. Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, convert-ing

10、 the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery,DNA甲基化状态的遗传和保持： DNA复制后，新合成链在DNMT1的作用下，以旧链为模板进行甲基化。（缺乏严格的精确性，95%） 甲基化并非基因沉默的原因而是基因沉默的结果，其以某种机制识别沉默基因，后进行甲基化。 DNA全新甲基化。引发因素可能包括： DNA本身的序列、成分和次级结构。 RNA根据序列同源性可能靶定的区域。 特定染色质蛋白、组蛋白修饰或相当有序的染色质结构,2021年2月2

11、日,28,DNA去甲基化 主动去甲基化 复制相关的去甲基化 在复制过程中维持甲基化酶活性被关闭或维持甲基化酶活性被抵制,一、DNA甲基化,2021年2月2日,28,DNA甲基化的检测方法,1.甲基化敏感的限制性内切酶法 2.基于亚硫酸氢盐修饰的方法 3.基于甲基化DNA特异结合富集方法,二、组蛋白修饰,组蛋白修饰是表观遗传研究的重要内容。 组蛋白的 N端是不稳定的、无一定组织的亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不同的化学修饰，这种修饰往往与基因的表达调控密切相关。 被组蛋白覆盖的基因如果要表达，首先要改变组蛋白的修饰状态，使其与DNA的结合由紧变松，这样靶基因才能与转录复合物相互作用。因此，组

12、蛋白是重要的染色体结构维持单元和基因表达的负控制因子,组蛋白修饰种类 乙酰化- 一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的 Lys 残基上。 甲基化- 发生在H3、H4的 Lys 和 Arg残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。 磷酸化- 发生与 Ser 残基，一般与基因活化相关。 泛素化- 一般是C端Lys修饰，启动基因表达。 SUMO（一种类泛素蛋白）化- 可稳定异染色质。 其他修饰（如ADP的核糖基化,Bryan M. Turner, nature cell biology, 2007,组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修

13、饰类型被称为组蛋白密码（histone code），遗传密码的表观遗传学延伸，决定了基因表达调控的状态，并且可遗传,主要的功能基团,Acetyl Methyl Phosphoryl Ubiquitin,组蛋白的共价修饰,组蛋白修饰,组蛋白修饰 (2,组蛋白的乙酰化,1. 通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反应： A. Histone acetyltransferase，HAT (30) B. Histone deacetylase, HDAC (18) 3. 分子效应：中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力 4. 生物学功能： A. 基因转录活化 B. DNA损伤修

14、复,组蛋白的甲基化,1. 主要发生在赖氨酸(K)或精氨酸(R)上； 2. Long-term； 3. HKMTs (histone lysine methyltransferases) vs. PRMTs (protein arginine methyltransferases) 4. 可逆的生化反应? 5. 分子效应：增加赖氨酸上的疏水力 6. 生物学功能： A. 基因转录活化 B. 基因转录沉默 C. X染色体失活 D. 异染色质致密状态 (heterochromatin compaction,组蛋白乙酰化、甲基化以及DNA甲基化的关系,A. MBD结合甲基化的DNA, 招募HDAC, 组

15、蛋白去乙酰化, 招募HMT, 甲基化组蛋白, 转录沉默； B. 组蛋白无乙酰化修饰, MBD结合甲基化的DNA, 再与SET结合，甲基化组蛋白 C. 甲基化的组蛋白尾部招募DNMT，对基因长期沉默,组蛋白的SUMO化,1. 通常发生在赖氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反应： A. E1, E2, & E3 B. SENPs 3. 生物学功能： A. 转录沉默 B. 抑制组蛋白的乙酰化和甲基化,组蛋白共价修饰的功能,基因转录、DNA损伤修复、DNA复制、染色体凝聚等,组蛋白修饰的检测方法,1.免疫染色 2.染色质免疫共沉淀 3.质谱,三、染色质重塑,染色质重塑（chromatin remodel

16、ing）是一个重要的表观遗传学机制。 染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程。 组蛋白尾巴的化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）可以改变染色质结构，从而影响邻近基因的活性,核小体,核小体定位是核小体在DNA上特异性定位的现象。 核小体核心DNA并不是随机的，其具备一定的定向特性。 核小体定位机制： 内在定位机制：每个核小体被定位于特定的DNA片断。 外在定位机制：内在定位结束后，核小体以确定的长度特性重复出现。 核小体定位的意义： 核小体定位是DNA正确包装的条件。 核小体定位影响染色质功能,染色质重塑,染色质 (Chromatin): 染色体上高

17、度致密的部分，通常不表达基因,常染色质与异染色质,1. 常染色质：基因表达活跃的区域，染色体结构较为疏松 2. 异染色质：基因表达沉默的区域，染色体结构致密,核小体,常染色质,异染色质,染色体上不同的区域,Euchromatin: 常染色质； Heterochromatin: 异染色质 E-H或H-称为染色质重塑(Chromatin Remodeling) 分子机理：DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑复合物的协同作用,染色质重塑的假设步骤,1. 两类酶调控染色质重塑的过程：组蛋白修饰因子 (histone modifiers) 以及ATP依赖的染色质重塑因子 (chromatin remod

18、elers) 2.组蛋白修饰因子并不改变核小体的位置，而是在DNA上作标记，以招募其他的活性成分 (组蛋白密码) 3.染色质重塑因子：水解ATP释放能量，从而改变染色质的结构 4.染色质重塑因子复合物,Ch11 opener p447,染色质重塑因子,核小体,染色质重塑因子与核小体的相互作用,组蛋白的乙酰转移酶的结合活化相应区域,去凝聚状态的染色质,活性染色质的产生,组蛋白乙酰化酶 染色质重塑复合物,组蛋白去乙酰化酶 染色质重塑复合物,Mediator-Pol II复合物：识别活化区域,OFF,ON,trxG,保持活性状态 (open chromatin,PRE,Target gene,组蛋白

19、的乙酰化和甲基化 (TAC1 and ASH1 complexes,组蛋白的去乙酰化和甲基化 (ESC-E(Z) complex,保持沉默状态 (compact chromatin,PcG,染色质重塑 - H2A Ubiquitination (PRC1 complex,染色质重塑 (BRM complex,Ac,Me K27 H3,Me K4 H3,Ub H2A,Pc-G vs. trx-G：作用机制,染色质修饰与重塑（共价修饰型与ATP依赖型,ATP依赖的染色质重构机制,四、RNA调控,1995，RNAi现象首次在线虫中发现。 1998，RNAi概念的首次提出。 1999，RNAi作用机制

20、模型的提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现RNAi现象。 2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。RNAi 技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。 至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门的方向之一,RNA干扰（RNAi）作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。 由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS ）。 RNA干扰是一种重要而普遍表观遗传的现象,siRNA siRNA结构：21-23nt的双链

21、结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配对的3碱基。 siRNA功能：是RNAi 作用的重要组分，是RNAi发生的中介分子。内源性siRNA是细胞能够抵御转座子、转基因和病毒的侵略,siRNA介导的RNAi,siRNAi 的特点： 高效性和浓度依赖性 特异性 位置效应 时间效应 细胞间RNAi的可传播性 多基因参与及ATP依赖性,miRNA 结构：21-25nt长的单链小分子RNA ，5端有一个磷酸基团，3端为羟基，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。 特点：具有高度的保守性、时序性和组织特异性 。 功能,siRNA介导的RNAi,五、其他表观遗传机制,除DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、和RNA调控以外，还有遗传印迹、X染色体失活、转座、负突变等。 遗传印迹、X染色体失活的本质仍为DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑,遗 传 印 迹,概念： 或称亲本印迹（parent imprinting） 是指基因组在传递遗传信息的过程中，通过基因组的化学修饰（DNA的甲基化；组蛋白的甲基化、乙酰