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文档简介

1、实验一,血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,一、实验目的,1,了解电泳的基本原理,2,掌握电泳分离蛋白质的原理,3,熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法,二、实验原理,1,电泳的基本原理,电泳,是带电粒子在电场中向其电性相反的电极,发生移动的现象,利用电泳技术可进行物质,分离,纯化,及,鉴定,影响带电粒子电泳速率的因素,1,带电量,F=qE,2,分子量,3,形状,2,电泳分离蛋白质的原理,蛋白质的两性解离,等电点,即,pI,isoelectric point,pI,pH,小于,pI,pH,大于,pI,当,pH,距离,pI,越远时，所带电量越多,OH,OH,H,H,血清蛋白质的等电点为,4.87.5,均低于,

2、8.6,因此,电泳时常采用,pH8.6,的缓冲液。此时，蛋白质解离,带负电荷，在电场中向正极移动,3,醋酸纤膜薄膜电泳分离血清蛋白质原理,醋酸纤维素薄膜电泳,是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳,技术,醋酸纤维素薄膜做区带电泳的支持物优点,1,用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用,2,快速简便，应用范围广,3,染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的,薄膜便于保存和定量分析,目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白,糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面,三、主要试剂与器材,试剂：血清,巴比妥缓冲液,染色液，漂洗液,器材：电泳仪，电泳槽,醋酸纤维素薄膜,2,8 cm,血清加样器,四、操作

3、步骤,1,浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中,充分浸透后用镊子取出（约,3-5 min,直到,膜上没有,斑点，中间没有气泡,为止,2,点样,毛面向上,用点样器，在距膜一端约,1.5 cm,处，点加,3-5,L,待分离血清。注意取样,适量,均匀,血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象,1.5cm,3,搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两,端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜,光面向上,平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向,点样的一端位于负极,点样线不能搭在滤纸上,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,4,电泳,红正,黑负,电压,120 V,电泳时间约,40 50 min,5,染色：氨基黑,10B,染色,1-2 min,6,脱色,2,个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染,料，直到背景漂白为止,五、结果与分析,1,定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带,2,定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法,六、临床意义,血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分,析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上,诊断肝、肾等疾,病,参考,1,肝硬化时,清蛋白明显降底,2,和,球蛋白无显,著变化，而,球蛋白可显著增加。正常生理情况，清蛋,白与球

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