上转换荧光的应用

1、上转换荧光的应用,Upconversion Luminescence,比较各种荧光成像技术的特性,单光子激发发光、双光子激发发光及上转换发光的成像形式比较,基于上转换发光的活体成像技术,上转换发光纳米材料在肿瘤靶向成像中的应用,Upconversion Luminescence,荧光成像具有价格低廉、成像快速的特点，并具有 分子水平的敏感性(单分子成像)。其中，荧光探针在荧光成像中起到对观察对象进行标记和示踪的作用,有机荧光团广泛用于荧光探针其光稳定性差，不适合长时间观察，且其吸收和发射带较宽，Stokes位移较小，在多色成像时易串色。 半导体量子点具有光稳定性好且发射峰窄的特点，在生物医学研

2、究中备受重视。但是，半导体量子点的潜在生物毒性和化学不稳定性限制了它在生物成像领域的进一步应用。 荧光染料和量子点通常是用高能量紫外(ultraviolet，UV) 或者可见光作为激发光，带来了一些明显的缺点，如较低的光穿透深度、可能的生物组织破坏，以及生物样品的自发荧光等,Upconversion Luminescence,上转换发光(upconversion luminescence，UCL) 是指稀土离子吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子的发光现象，通常是指近红外(near infrared，NIR) 光转换为可见光。迄今为止，上转换材料主要是掺杂稀土元素的固体化合物，利用稀土

3、元素的亚稳态能级特性，可以吸收多个低能量的长波辐射，从而使人眼看不见的红外光变成可见光。 相比有机荧光染料和量子点等下转换发光标记而言，上转换发光标记因采用近红外连续激光作为激发源，具有较深的光穿透深度、无生物背景荧光干扰、对生物组织几乎无损伤等显著优势,Upconversion Luminescence,我们对UCNPs的上转换发光的成像形式（C）、有机染料(以罗丹明B为例) 的单光子（A）及双光子（B）激发发光的成像形式进行了比较,在罗丹明B的单光子激发中，除了焦点处的染料分子产生荧光，焦平面上下的染料分子也被激发产生荧光。非焦面的荧光会严重地影响焦面处的图像，为了消除非焦面发光的影响，共

4、聚焦荧光显微镜采用了针孔技术。在罗丹明B的双光子激发中，由于激发功率和发射强度存在平方关系，只有激光束聚焦的焦点处的染料分子被有效激发而发光；因此，双光子荧光成像具有内在的三维分辨率，不需要使用针孔技术。对UCNPs的上转换发光而言，沿着激发光的路径都有上转换发光。此外，稀土离子的摩尔吸光系数很低，对激发光的能量改变很小，因此上转换发光在焦平面上方和下方呈对称的圆锥形分布,Upconversion Luminescence,焦点处的光子密度最大，随着与焦点的距离增大，光子密度迅速下降,多光子的吸收和能量转移是通过一系列实际存在的中间能级实现的，表现为激发功率和UCNPs的上转换发光强度之间存在

5、非线性关系。以上实验结果说明：UCNPs的上转换发光的成像形式明显不同于有机染料的单光子及双光子激发发光的成像形式。非焦面的上转换发光信号对 UCNPs用于生物成像非常不利,Upconversion Luminescence,2009年，我们发展了激光扫描上转换发光显微成像 (laser scanning up-conversion luminescence microscopy, LSUCLM) 技术，图 3 给出了激光扫描上转换发光显微镜的光路图。激光器发出的 980 nm 连续激光，首先通过整合扫描镜，然后被物镜聚焦到样品上；从扫描点上产生的发射光被整合扫描镜反射，然后通过一个反式的激发

6、二色分镜 (短通)，以滤掉 980 nm 激发光；发射光随后通过共聚焦针孔和一个选择收集波长范围的狭缝光栅或带通滤光片，最后进入光电倍增管而被检测。其中，引入共聚焦针孔技术可以有效地消除非焦面的上转换发光的干扰，同时避免了焦面内散射光的影响，从而高分辨率。由于共聚焦针孔技术具有“光学切片”能力，用 LSUCLM 可以对上转换发光图像进行三维重建，实现三维上转换发光成像,Upconversion Luminescence,用 DiI (红色) 和低浓度的 UCNPs (绿色) 对活细胞进行标记 (图 3)。值得注意的是，尽管 UCNPs 的上转换发光信号的收集范围 (500600 nm) 已经覆

7、盖了 DiI 信号采集范围 (560600 nm)，单细胞的上转换发光图像上仍然没有来自 DiI 和自发荧光的信号。这归功于传统发光材料对980 nm 光的单光子吸收很弱，且传统发光材料在连续光激发下同时吸收两个光子的几率很低。因此，以 UCNPs 为探针的 LSUCLM 成像方法，能够完全消除来自内源性荧光物质和同时标记的荧光染料的背景干扰，对所要成像的对象具有高灵敏度。 如图 4 所示，980 nm 连续激光的持续照射对 UCNPs 和有机染料的光漂白很弱，和普通共聚焦显微成像相比，LSUCLM 的光漂白更弱,Upconversion Luminescence,1,和传统的单光子、双光子荧

8、光成像技术相比，以 UCNPs 为发光探针的 LSUCLM 由于采用了 980 nm 连续激光作为激发源，具有很多独特的优点：1) 对有机染料和 UCNPs 的光漂白均非常低，可用于长期成像；2) 完全消除了来自内源性荧光物质和同时标记的荧光染料的背景干扰，对所要成像的对象具有超高的选择性和灵敏度；3) 使用廉价的近红外连续激光器作激发光源，有望被更多的研究者使用；4) 可以和普通共聚焦荧光成像系统很好地联用，可以对 UCNPs和有机荧光染料等多种探针同时标记的生物样品成像，能显示复杂的生物样品中更多的细节。由于 LSUCLM 具有上述优势，这一成像技术在化学、材料科学、生命科学及医学研究中具

9、有广阔的应用前景。 基于上转换发光的活体成像技术 上转化纳米材料料在肿瘤靶向成像中的应用,Upconversion Luminescence,基于上转换发光的激光扫描上转换发光显微成像技术，能够很好地解决细胞内的背景荧光干扰，从而实现在无自发荧光环境下的信号探测。但动物活体成像自发荧光干扰的问题尚未解决，仍然需要进一步的研究,如图 5 所示，半导体激光器 (中心波长为 980 nm) 产生的稳态激光束均通过光纤导入，沿激光束前进方向上依次放置扩束透镜和光束整形镜，在两束激光束侧下方放置样品台，小动物位于样品台上；通过发射滤光片选择一定波长范围的信号，由 EMCCD 接收。我们利用该系统成功地将

10、稀土上转换发光成像技术用于小动物活体成像,稳态激光泵浦上转换发 光小动物活体成像系统,Upconversion Luminescence,基于上转换发光的活体成像系统安装半导体激光器 (中心波长为 980 nm)具有以下优点：1) 该系统是一种高灵敏度的成像技术，生物样品内源性荧光物质和常用的有机荧光染料不具备上转换发光性能，这使得该系统能有效地消除生物样品自发荧光和有机荧光染料发光等背景荧光的干扰；2) 该系统是一种能对生物样品进行较长时间连续观察的成像技术，由于稳态激光泵浦的上转换发光材料在稳态近红外激光激发下几乎不被光漂白，而且稳态近红外激光对有机荧光染料的光漂白很弱，对生物样品的损伤小

11、；3) 该系统价廉，易于推广。与双光子荧光探针采用昂贵的飞秒激光器相比，采用 980 nm 连续光半导体激光作为激发光源，价格低廉，易于普及,Upconversion Luminescence,上转换发光纳米材料在肿瘤靶向成像中的应用 肿瘤细胞表面存在这样一些特异性的受体，会在肿瘤组织中过度表达，而在正常组织中不表达或低表达。借助这些受体介导的内吞作用，利用配体 - 受体的高度结合能力，将所结合的特异性配体靶向转运到特定的组织和细胞，以达到肿瘤组织靶向分布和显像的目的。偶联生物分子的上转换发光纳米粒子已经运用于肿瘤跟踪等方面的活体靶向成像。 值得说明的是，上转换发光在活体中荧光信号的区域 (r

12、egion of interest，ROI) 分析显示出，上转换发光成像在肿瘤和背景之间的信噪比高至24，而这是单光子和双光子荧光成像无法达到的效果,Upconversion Luminescence,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid, RGD) 肽和叶酸(folic acid, FA) 是重要的配体，将RGD肽、叶酸连接到UCNPs上用于肿瘤细胞的成像最近被陆续报道。基于RGD肽与、整合素受体之间的高亲和力，同时为了满足细胞组织和活体成像对材料有不同穿透深度的需求，我们设计合成了具有绿光、红光和近红外光发射的稀土上转换发光纳米材料UCNPs(NaYF420%Yb, 1.8%Er, 0.2%Tm) 作为荧光探针用于RGD肽标记。无胸腺的裸鼠活体成像结果显示：RGD肽标记的UCNPs具有很好的肿瘤靶向效果。组织切片的Z扫描成像数据证明，上转换成像甚至在组织深度600滋m仍没有自发荧光干扰,Upconversion Luminescence,展 望 生物成像的最终目的是通过荧光标记探针实现对生物样本中个生物分子进行超灵敏检测，欲提高生物成像的效果以及检测灵敏性，就需要寻找信号稳定、标记简便、安全无毒、检测灵敏的标记物。上转换发光纳米材料具有光稳定性、化学稳定性高、吸收和发射带很窄、发光寿命长、潜在生物毒性小等优点；另外，采用