荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用

1、荧光原位杂交技术(FISH)在临床病理中的应用与质控,广西至科大学一附院病理科 王华,荧光原位杂交技术(FISH): 用带有荧光素标记的核酸探针与组织细胞中待测的核酸(DNA、RNA)按碱基配对的原则进行特异性结合，在荧光显微镜下显示细胞基因状态的方法。 FISH在临床病理中的应用 辅助病理诊断、判断预后、指导临床治疗,一、常用荧光素及滤光片类型,二、常用探针种类,单色探针(single color probe, SC) 双色探针(dual color probe, DC) 三色探针(triple color probe, TC) 双色分离探针(dual color, break apart

2、probe. DC,BCR) 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF Trans) 额外信号探针(extra signal. ES) 双色双融合探针 (dual color,dual fusion probe. DC,DF Trans,单色探针(SC,正常,异常,CEP8,双色探针(DC,正常,异常,HER2,CEP17,三色探针(TC,正常,异常,X,Y,CEP18,双色分离探针(DC,BCR,正常,异常,MYC,MYC,14,18,14,18,双色单融合探针(DC, SF Trans,正常,异常,ABL,ABL,9,22,9,22,BCR,BCR

3、,额外信号探针(ES,正常,异常,ABL,ABL,9,22,9,22,BCR,BCR,双色双融合探针( DC,DF Trans,正常,异常,IGH,IGH,14,18,14,18,BCL2,BCL2,三、FISH检测在常见肿瘤中的应用与意义,乳腺癌,探针: HER2/CSP17（双色探针） HER2基因检测意义： HER2基目扩增的患者预后差:无病生存和总生存期缩短，淋巴结转移几率高，复发凤险高。 指导内分泌冶疗：HER2基因扩增患者对内分泌治疗产生耐药。 指导合理选择辅助化疗方案：HER2基因扩增患者宜采用紫杉醇化疗和高强度的蒽环类药物方案。 筛选分子靶向药物的适用者：HER2基因扩增患者适

4、合使用曲妥珠单抗药物,探针：TOP2A/CSP17（双色探针） TOP2A基因两种异常：扩增和缺失。 TOP2A基因检测的意义： 存在TOP2A基因异常的患者预后差，尤其是基因缺失的患者预后更差。 TOP2A基因异常患者对于含蒽环类药物的治疗方案更敏感,非小细胞肺癌,探针：EGFR/CSP7（双色探针） EGFR基因异常：扩增和拷贝数增加。 EGFR基因检测的意义： 30%40%非小细胞肺癌存在EGFR基因异常. 筛选酪氨酸激酶抑制剂适用者：EGFR基因增多的患者，应用Iressa/Tarceva治疗的有效率为35%，疾病控制率高达70,EGFR (-) 2G + 2R Ratio: 2.0,

5、 EGFR FISH (,EGFR (+) Ratio: 2.0, EGFR FISH (,滤泡性淋巴瘤,探针: BCL2/IGH （双色双融合探针） BCL2基因位于18q21， IGH基因位于14q32. BCL2/IGH融合基因导致BCL2蛋白的过度表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖引发肿瘤。 BCL2/IGH融合基因检测意义: 辅助诊断FL ：BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中。 BCL2/IGH持续阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者3年生存率只有54%；阴性者3年疾病无进展的患者87.5%，而阳性者只有13,BCL2/IGH 正常,BCL2/IG

6、H断裂、平衡易位,弥漫性大B细胞淋巴瘤,探针：BCL6（双色分离探针） BCL6基因位于3q27，主要有t(3;14)，t(3;22)和t(2;3)3种易位，分别是BCL6与免疫球蛋白Ig的重链(IGH)、轻链(IGL)、轻链(IGK)区域易位。 BCL6 基因断裂检测意义 目前研究确定至少40%的DLBCL涉及3q27染色体易位或者BCL6基因重排。 BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好,BCL6断裂,BCL6正常,套细胞淋巴瘤,探针：CCND1/IGH（双色双分离探针） CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。CC

7、ND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞增生。 CCND1/IGH融合基因检测意义 CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96,CCND1/IGH正常,CCND1/IGH断裂易位,伯基特淋巴瘤,探针:C-MYC（双色分离探针） 8号染色体上C-MYC基因最常见的是t(8；14)，导致8号染色体上C-MYC基因和l4号染色体上IGH增强子元件并列,也可发生t(2；8)(p12；q24)，或t(8；22)(q24；ql1) C-MYC基因断裂检测意义 约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)（q24;q32）； 约

8、15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)； 约5%发生t(8；22)（q24;q11）。 C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断,C-MYC正常,C-MYC断裂,MALT淋巴瘤,探针： MALT1（双色分离探针） API2/MALT1（双色双融合探针） API2（11q21）MALTI（18q21）易位形成API2/MALTI融合基因，产生API2/MALTI融合蛋白，导致细胞增殖，引起肿瘤。 MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义 10%-20%的粘膜性淋巴组织淋巴瘤中会存在MALT1 基因的断裂重组，辅助诊断M

9、ALT淋巴瘤。 指导针对胃API1/MALT1淋巴瘤患者的抗幽门螺旋菌治疗： 存在MALT1 基因的断裂重组的患者不适合用抗生素治疗。 预后判断：存在MALT1 基因的断裂重组的节外胃淋巴瘤患者更容易出现局部进展期病变,MALT正常,MALT断裂,API2/MALT正常,API2/MALT断裂易位,滑膜肉瘤,探针：SYT SYT基因位于18q112,又称SSl8或SSXT基因 。 SYT基因检测意义 辅助诊断滑膜肉瘤。 文献报道，90以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位t(X；18)(p112；q112)，导致位于18q112的SYT基因和位于Xp112的SSX基因融合,脂肪肉瘤,探针：MDM2/C

10、EN12 MDM2基因检测意义： 辅助诊断高分化脂肪肉瘤。 文献报导：90%高分化脂肪肉瘤中MDM2基因存在扩增,胃肠道间质瘤,探针：CCND1/CEN11 MDM2/CEN12 检测意义： CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。 MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性,前列腺癌,探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG 检测意义： PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者

11、8年生存期达90,神经母细胞瘤、神经胶质瘤,探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11 检测意义： 在神经母细胞瘤患者中，1p丢失是强烈的预后差因子，提示临床应采取积极主动的治疗策略； 结合1p，19q基因状态可辅助治疗和预测退行性少突神经胶质瘤的预后效果。 NMYC基因扩增为预后差因子，指导个性化治疗,黑色素瘤,探针：PTEN/CEN10 检测意义： PTEN基因缺失导致PI3K/AKT（磷酸肌醇3激酶 /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 ）途经激活，指导抗PI3K/AKT通路药物。 PTEN基因缺失的患者预后差,宫颈CIN、宫颈癌,探针：TERC/CSP3 检测意义： 对于C

12、IN1/CIN2的患者，TERC基因扩增的患者发生进展/恶变的可能性超过50%，需要及时治疗。 辅助明确宫颈CIN分级，选择合理的治疗方案,膀胱癌,探针：CSP3/CSP7 P16/CSP17 检测意义： 膀胱癌9号染色体部分(P16位点)缺失或全部丢失是最常见的遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的旱期发望密切相关。 膀胱癌的发展与染色体不稳定性(如3号、7号、17号染色体的非整倍性)紧密相连。 早期无创性诊断泌尿系统移行上皮癌。 泌尿系统移行上皮癌术后复发监测,四、FISH操作流程,石蜡切片58-60过夜 二甲苯脱蜡，酒精脱二甲苯，水化组织 高压处理组织切片 胃蛋白酶处理组织 干燥组织切片后滴

13、加探针，加盖玻片与封固剂 高温（7395）变性 杂交16小时（过夜） 揭去橡胶水泥和盖玻片,进入杂交后洗涤 酒精脱水、晾干。 滴加DAPI荧光封片剂 荧光显微镜下观察,五、FISH判读标准,乳腺癌HER2基因检测: 20个肿瘤细胞HER2基因（红信号）点数总和与CEN-17（绿信号）点数总和的比值。 HER2/CEN-172.2 HER2基因有扩增 HER2/CEN-171.8 HER2基因无扩增 HER2/CEN-17 1.82.2 定为不确定结果。 需重新再进行另外20个的细胞计数或重复FISH检测，如仍不确定，则建议临床结合IHC检测HER2蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗,CEN-17

14、多体性：计算以上计数的20个细胞的绿信号点数均值。 CEN-17均值 1.75 亚二体性 CEN-17均值 1.762.25 二体性 CEN-17均值 2.263.75 低多体性 CEN-17均值 3.76 高多体性,非小细胞肺癌EGFR基因检测: 50个肿瘤细胞EGFR基因（红信号）点数总和与CEN-7（绿信号）点数总和的比值。 EGFR基因扩增阳性： EGFR基因簇状扩增 EGFR/CEN-72.0 40% 肿瘤细胞红色信号4个,六、FISH检测规范与质控,影响FISH制片质量的因素 组织处理的规范化: 及时固定:冷缺血时间1h 4%中性缓冲甲醛6-48h 不推荐微波固定 乙醇脱水 浸蜡温度68 不使用快速石蜡组织做FISH检测,脱蜡、脱二甲苯 组织消化 变性、杂交的温度 杂交后洗涤液PH值 6周的组织切片不应再用于FISH检测,影响FISH判读的因素 采用正确的滤光片观察 Orange/red 正确判定肿瘤细胞(HEIHCFISH) 肿瘤异质性表达 导管内癌/浸润性癌 浸润性癌