浅析恶性疟疾疫苗的研制

1、浅析恶性疟疾疫苗的研制疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病，是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上约有 20 亿人口生活在疫区1.在我国，疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。2010 年我国政府公布了中国消除疟疾行动计划（2010 2020 年），提出在 2020 年全国实现消除疟疾的目标2.因此，对中国以及全球来说，迫切需要研制预防疟疾的疫苗。疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清楚，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。根据疟原虫在人体的生活史，可将疟疾疫苗分

2、为 3 种，即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子表面的环子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame 等3研究发现，在 CSP 蛋白中存在重复 37 次的 Asn-Ala-Asn-Pro（NANP）四肽重复序列（NANP repeated motif），该序列重复 4 次，而且这种重复无株间差异。Gerloni 等4-5构建了包含3个重复的 NANP 四肽重复序列的 IgG 重链基因的重组质粒，并用该质粒免疫小鼠后，在持续 2 年的时间内观察到机体产生了特异的抗 NANP 反应。Kubler-Kiel

3、b 等6通过蛋白质水平的偶联技术，实现了将 4 或 5 个重复的 NANP 四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接，并将此复合物免疫小鼠，结果显示，小鼠体内可产生特异性的抗 pfs25 蛋白及抗 CSP 应答。基于 CSP 蛋白结构，美国葛兰素史克生物公司（GSK）研发了 RTS,S / AS01 恶性疟疾疫苗，2011 年的初步研究结果显示，在为期 12 个月的观察期内，6 000 名 5 17 月龄幼儿注射 3 剂疫苗后，患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了 56%和 47%7.这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。NANP 四肽重复序列仅是 CSP 蛋白质的一个结构区域，若开发

4、针对该四肽重复序列的单克隆抗体，则可提供检测该序列的特异性和敏感性，有益于基于 NANP 四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此，本实验以 BSA（-NANP）5 偶联蛋白为免疫原，利用经典杂交瘤技术，筛选出 10 株杂交瘤细胞株，为进一步的研究工作奠定基础。1 材料与方法1. 1 多肽及细胞 （NANP）5 多肽、（NANP）5C 多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成，经HPLC 纯化后纯度为 95%,各合成 50 mg;SP2 / 0 骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。1. 2 实验动物 SPF 级 BALB / c 鼠，雌性，6 8 周龄，体重 12 14 g,动物合格证号为：SYX

5、K（甘2012-0002）；清洁级 F1 鼠，雌性，体重 16 g 以上，动物合格证号为：SYXK（甘 2012-0003），均由本公司动物实验室提供。1. 3 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤（hy-poxantin,HAT）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）培养基购自美国 GIBCO 公司；HRP、过碘酸钠（NaIO4）、HRP 标记的兔抗鼠 IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼（adipicdihydrazide,ADH）、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺1-Ethyl-3-（3-Dimethylaminopropyl）

6、CarbodiimideHydrochloride,EDC购自美国 Sigma 公司；Imject Ma-leimide Activated BSA Kit 购自美国 Thermo Scienti-fic 公司；弗氏佐剂由本公司第四研究室制备；2（-N-吗啉代）乙磺酸2（-N-Morpholino）ethanesulfonic acidhydrat,MES、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝 R-250 等为国产试剂。1. 4 抗原板条 （NANP）5 及（NANP）5C 多肽、戊型肝炎病毒（HEV）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic

7、factor,CNTF）等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存；CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠8,并由本公司第四研究室制备抗原板条。1. 5 完全抗原的制备 选择 BSA 作为载体蛋白，应用以下 2 种方法将（NANP）5 或（NANP）5C 多肽与载体蛋白偶联。方法 1马来酰亚胺修饰的 BSA 与（NANP）5C偶联法：马来酰亚胺修饰的BSA与（NANP）5C 偶联，具体操作按 Imject Maleimide ActivatedBSA Kit 试剂盒说明书进行：用 1 ml 的偶联缓冲液（0. 083 mol / L sodium phosphate,0. 1 mol /

8、L EDTA,0. 9 mol / L NaCl,0. 1 mol / L sorbitol,0. 02%叠氮钠，pH 7. 2）配制马来酰亚胺修饰的 BSA,使载体蛋白终浓度为 10 mg / ml,取 0. 5 ml 用于偶联，同时用0. 5 ml 偶联缓冲液配制（NANP）5C 多肽 25 mg,终浓度为 50 mg / ml;将多肽与载体蛋白混匀，室温孵育 180 min;以 0. 083 mol / L PBS,pH 7. 2 作为透析缓冲液透析偶联产物，过夜。方法 2ADH-EDC介导的 BSA 与（NANP）5 偶联法:在 0. 5 ml BSA（25 mg / ml）中加入 0

9、. 5 ml ADH（以 0. 1 mol / LNaCl 为溶剂配制，浓度为 0. 25 mol / L），加入 0. 5 ml0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,加入 4. 5 mg EDC（浓度为 0. 05 mol / L），室温反应 6 h,期间用 0. 05 mol / LHCl 调 pH 至 5. 6;以 0. 5 mol / L NaCl,pH 7. 2 作为透析缓冲液，透析偶联产物，过夜；取 0. 5 ml 透析产物，加入 0. 5 m（lNANP）5（以 0. 2 mol / L MES 为溶剂配制，浓度为 10 mg / ml）和 0. 5 ml 0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5