阻断TRPV4抑制大鼠无菌性心包炎模型心房纤维化及心房颤动的发作

1、阻断TRPV4卩制大鼠无菌性心包炎模型心房纤维化及心房颤动的发作第一部分:TRPV4参与大鼠无菌性心包炎模型心房颤动的发生目的: 建立稳定的大鼠无菌性心包炎心房颤动 （ 房颤） 模型, 观察 TRPV4 在无菌性心包炎模型大鼠心房组织中的表达及功能变化。给予 TRPV4 口服抑制剂GSK2193874台疗无菌性心包炎模型大鼠，观察房颤的发 生率及持续时间有无变化。 收集临床接受主动脉旁路移植术的房颤患 者及窦性心律患者的心房组织标本，检测二者TRPV4表达有无差异， 进一步明确TRPV4与房颤之间的关系。方法：在大鼠心房表面均匀播 撒无菌性滑石粉 , 建立大鼠无菌性心包炎房颤模型。在手术后的不

2、同 时间点 （1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d）, 运用 western blot 技术, 检测心房 及心室组织TRPV4S道蛋白的表达变化。同时，采集各组大鼠心房组 织做冰冻切片，进行免疫荧光染色，观察TRPV4通道的表达及分布有 无变化。将SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle 组（给予等量6% 羟丙基-B -环糊精灌胃处理）;GSK2193874组（给予TRPV4特异性阻断 剂GSK2193874 10mg/kgl胃治疗）。在手术后第3d,应用大鼠食道调 搏技术 , 记录各组大鼠文氏点、窦房结恢复时间、房颤诱发率及房颤 持续时间等指标 , 并比较各组之间有无差异。收集

3、临床接受冠状动脉 旁路移植术的窦性心律及房颤患者的心房组织 ,western blot 技术检 测二者心房TRPV4表达水平有无差异。结果：无菌性心包炎手术后第 1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d,大鼠心房组织TRPV4蛋白表达量持续高于sham组,在术后第1d达高峰；手术后第14d,TRPV4蛋白表达量有所下降，但依然显著高于sham组。各组大鼠心室组织TRPV蛋白表达水平 未见明显改变。免疫荧光结果显示，sham组大鼠心房组织TRPV主要 分布于细胞核周围，细胞膜上TRPV4表达很少;而无菌性心包炎模型 组大鼠心房组织中,TRPV4在细胞膜上的表达量显著增多。电生理检 测结果显示

4、,vehicle 组大鼠房颤持续时间与房颤诱发率显著高于 sham组;GSK2193874组大鼠房颤的持续时间及诱发率则显著下降。临床患者心房组织检测结果显示，房颤患者心房组织TRPV4含量显著高 于窦性心律患者。结论:TRPV4通道参与大鼠无菌性心包炎模型房颤 发作,阻断TRPV4有效抑制大鼠无菌性心包炎模型房颤发作;TRPV4 可能参与临床房颤患者的病理进程，阻断TRPV4有望成为临床治疗房 颤的新靶点。第二部分：阻断TRPV刑抑制大鼠心房成纤维细胞增殖 及分化目的：心房纤维化参与房颤发生,TRPV4是否通过诱导心房纤维 化进而参与房颤发作 , 至今尚未见相关研究报道。本实验拟通过利用 大

5、鼠无菌性心包炎房颤模型，探讨TRPV4在心房纤维化中的作用及其 潜在的分子机制。方法:SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle 组（给 予等量6话丙基-B -环糊精灌胃处理）;GSK2193874组（给予TRPV4t 异性阻断剂 GSK219387410mg/kg 灌胃治疗 ） 。于无菌性心包炎手术前 1d,给予vehicle组及GSK2193874S大鼠体重比例的溶剂或阻断剂处 理，持续至SP手术后第2d。SP手术后第3d处死大鼠，留取左、右心 房标本备用。Real Time PCR技术检测各组大鼠心房组织纤维化相关 指标 TGF-B 1、COL-I、COL-皿、a-SMA的 mRN

6、表达变化。Mass on 染色检测各组大鼠心房组织胶原含量 , 免疫组化染色检测心房 a-SMA 表达变化。 Western blot 技术检测大鼠心房组织纤维化相关信号通 路蛋白STAT3 AKT/GSK-3心、ERK表达水平有无改变。分离培养各组大鼠心房成纤维细胞，使用多功能酶标仪检测TRPV4激动剂 GSK1016790AI起的细胞钙离子内流有无差异。预先给予TRPV4S道特异性阻断剂GSK219387孵育心房成纤维细胞，再观察GSK1016790A 引起的钙离子内流有无变化。 运用膜片钳技术记录各组大鼠心房成纤 维细胞TRPV4S道给药前及给予GSK1016790A寸的电流大小，比较两

7、 组心房成纤维细胞TRPV4电流有无差异。分离培养的大鼠成纤维细胞， 阻断或激动TRPV4,RT-PC检测纤维化相关指标TGF-B、COL-I、COL- 皿、a-SMA的mRN水平有无变化；阻断AKT STAT3言号通路，检测激 动TRPV4后成纤维细胞上述纤维化指标有何变化。结果 :Real Time PCF结果显示vehicle组大鼠心房组织纤维化相关指标TGF-p、COL- I、COL-皿、a-SMA的 mRN表达水平显著高于 Sham组。Masson染色 与免疫组化染色结果显示,Control组大鼠心房组织胶原及a-SMA含 量显著高于Sham组。GSK2193874&大鼠心房组织纤维

8、化指标的表达 量显著降低。 Western blot 结果显示 ,vehicle 组大鼠心房组织纤维 化相关信号通路蛋白STAT3AKTGSK-3S的磷酸化水平显著高于sham 组；阻断 TRPV4后 ,GSK2193874组大鼠心房 STAT3 AKT GSK-3S蛋白 的磷酸化水平显著降低，差异具有统计学意义；各组大鼠心房ERK表 达水平未见明显改变。胞内钙检测结果显示 ,Vehicle 组大鼠心房成 纤维细胞对TRPV4激动剂GSK1016790A勺反应性显著高于sham组。应用TRPV4特异性阻断剂GSK219387预先处理细胞后,GSK1016790A 引起的细胞内钙离子内流可被有效

9、抑制。 膜片钳结果显示 , 给予 TRPV4 激动剂灌注时，SP大鼠心房成纤维细胞TRPV4&流升高幅度显著高于 sham组细胞。细胞实验显示，激动TRPV4后,成纤维细胞纤维化相关 指标TGF-B、COL-I、COL-皿、a-SMA的mRNA水平显著增高，而抑制 TRPV4则可有效抑制纤维化指标的 mRN表达水平。此外，在细胞水平 阻断AKT STAT3通路，可有效抑制TRPV4激动引起的致纤维化效应。 结论：无菌性心包炎模型大鼠心房成纤维细胞 TRPV4功能增强,参与 心房纤维化的形成；阻断TRPV4可有效抑制心房组织纤维化病理改变。 TRPV4激活后，可能通过上调AKT/GSK-33、S

10、TAT3磷酸化水平，促进 成纤维细胞增殖分化及胶原合成 , 诱导心房纤维化 , 进而参与房颤发 生。第三部分阻断TRPV4寸无菌性心包炎模型大鼠心房电重构的影响 目的 ： 心脏电重构在房颤中的作用已经被明确 , 本部分实验拟通过大 鼠无菌性心包炎模型，研究TRPV4在心脏电重构中的作用及其潜在的 可能机制。方法:SD大鼠随机分为3组:sham组;vehicle 组（给予等 量6涛丙基-B -环糊精）;GSK2193874组（给予TRPV術异性阻断剂 GSK2193874 10mg/kg。于无菌性心包炎手术前 1d,给予vehicle组 及GSK219387俎大鼠体重比例的溶剂或阻断剂灌胃处理，

11、持续至手 术后第2d。在手术后第3天，分离各组大鼠心脏并用Langendorff灌 流系统进行灌流，使用Mapp in gLab系统检测大鼠左心房在7Hz刺激下 的传导速度及传导异质性。随后，记录大鼠右心房7Hz刺激下动作电 位时程。所有检测完成后 , 留取大鼠心房组织标本 :Western blot 技 术检测各组大鼠心房组织电传导相关蛋白缝隙连接蛋白43(connexin43) 、小凹蛋白 -3(caveolin-3) 的表达变化 ; 免疫组织化 学染色法检测各组大鼠心房组织 connexin43 分布情况。结 果 :Mapping 检测结果显示 ,vehicle 组大鼠心房组织传导模式紊

12、乱 , 传导异质性显著增加；而阻断TRPV4后,GSK2193874组大鼠心房传导 模式趋向正常 , 传导异质性显著降低。动作电位记录结果显 示vehicle 组大鼠心房组织单向动作电位时程(APD)显著延长，阻断 TRPV4H,GSK2193874组大鼠心房APD缩短至正常水平。Western blot 结果显示 ,vehiclel 组大鼠心房组织 caveolin-3 表达水平显著低于 sham组,而GSK219387组大鼠心房组织caveolin-3恢复至正常水平。 免疫组化染色结果显示 :sham 组大鼠心房组织 connexin43 主要分布 于心肌细胞闰盘处 , 很少见侧边化分布 ； 而 v