遗传多样性桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析

1、遗传多样性桦褐孔菌菌株遗传多样性的 ISSR 分析 应用 ISSR (inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21株不同的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株进行DNA指纹图谱分析，结果表明：从60条引物中筛选出11条ISSR引物对桦褐孔菌基 因组DNA进行了 ISSR-PCRT增，共扩增出DNA谱带183条，其中多 态性谱带 169 条，多态位点百分率为 92.3 ，遗传相似系数变化范 围为0.6050.880。在遗传相似系数为0.763时，可将21个桦褐孔 菌菌株划为 6 大类群，菌株聚类结果与菌株的地理分布有关。桦褐孔菌； ISSR； 遗传多

2、样性桦褐孔菌 (Inonotus obliquus) 属多孔菌科( Polyporaceae )、 纤孔菌属(Inonotus ),是十分珍稀而又名贵的药用真菌1,以其 菌核入药2。桦褐孔菌主要分布在东欧的 _ 、波兰等国家 , 我国 主要分布于大、小兴安岭和长白山地区, 其野生资源已濒临灭绝 3, 人工栽培刚刚起步, 很少能获得子实体, 而桦褐孔菌育种研究目前尚 属空白，从DNA分子水平上弄清不同地理菌株间的遗传关系对该菌的 育种具有重要意义。ISSR (inter-simple sequenee repeat)是 ZIETKIEWIEZ等在1994年提出的一种锚定SSR的方法4,可直接对基

3、因组DNA进行 分析,不受任何环境条件影响,操作简单,多态性高,重复性好,被看作是克服了 RFLF和RAPC许多局限性的新标记5,该技术在灵 芝( Ganodermalucidum ) 6、茯苓( Poria cocos) 7、毛木 耳(Auricularia polytricha ) 8禾口蜜环菌 (Armillaria mellea ) 9等药用真菌遗传多样性分析中已有应用,而利用分子标记对桦 褐孔菌遗传差异的研究报道较少。笔者利用ISSR标记技术，分析了21株不同的桦褐孔菌菌株的遗传差异, 旨在为桦褐孔菌的品种选育、 资源保护和开发利用等工作提供参考。1 材料与方法1.1 供试菌株各菌株

4、编号及见表 1,其中芬兰菌株由北京林业大学戴玉成教 授赠送, 日本菌株由日本鸟取大学北本丰教授赠送, 其它菌株由长白 山生物资源与功能分子 _ 重点实验室保藏。1.2 菌丝体培养取活化的菌丝体，接种于斜面培养基中(20 g葡萄糖，2 g蛋 白胨, 2 g 酵母膏, 0.5 g 硫酸镁, 0.5 g 磷酸二氢钾, 15 g 琼脂, 加水至1000 mL, pH自然)，25 C暗培养20 d，待菌丝满管后，收 集菌丝，无菌水洗涤2次，用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分，-20 C 保存备用。1.3 总DNA提取及检测采用改良的CTAB法: 10提取基因组总DNA 0.7 %琼脂糖凝 胶电泳检测质量。1

5、.4PCR 反应及电泳引物参照哥伦比亚大学(UBC)公布的ISSR引物序列，由北京 英骏生物工程有限公司合成。PCR反应在MG96C型PCF仪上进行。PCF反应体系：模板DNA10 ng/ 卩 L, dNTPslOO 卩 mol/L，引物 25 卩 mol/L , Taq DNA聚合酶 0.5 U, Mg2+ 1.4 mmol/L , 10 x buffer 2.5 卩 L,用 ddH 20补至总 体积25卩L。扩增程序为：94 C预变性5 min , 30个循环：94 C 变性1 min、4551 C退火1 min(退火温度因不同引物而定)、72 C 延伸1 min，最后72 C延伸5 mi

6、n , 4 C保存。PCF产物在1.5%琼 脂糖凝胶上电泳，用GelDoc-It型凝胶成像系统照相。1.5数据分析将ISSR图谱以TIFF文件格式保存，有ISSR谱带的计为1,无 带计为0,构成ISSR表型矩阵，输入NTSYSpc2.0软件进行分析，计 算遗传相似系数，以平均连锁法（UPGMA进行聚类分析，获得树状 聚类图。2 结果与分析2.1 桦褐孔菌遗传多态性分析实验以21个菌株对60条ISSR引物进行了筛选，其中有11条 引物能扩增出清晰且具多态性的带谱, 引物序列见表 2。11 条 ISSR 引物对 21 个桦褐孔菌菌株共扩增出 183条带（表 2）,其中多态性 条带169条，多态位点

7、百分率为92.3 %,每条引物扩增出1220条 谱带，DNA片段大小为1002200 bp。图2为UBC842引物扩增21株 桦褐孔菌菌株DNA的ISSR指纹图谱。Fig.1 ISSR fingerprinting profiles of I. obliquus strains amplified with primer UBC8422.2 桦褐孔菌遗传相似系数分析遗传相似矩阵分析表明， 21 个桦褐孔菌菌株的遗传相似系数变化范围为0.6050.880，遗传差异变化较大，说明野生桦褐孔菌的 遗传背景较丰富（表 3）。2.3 桦褐孔菌UPGM聚类分析采用UPGM法对21个桦褐孔菌菌株的遗传相似系数进行了聚类 分析，构建亲缘关系树状图。从图 2 可以看出，供试菌株的遗传相似 水平在 0.668 0.882 之间，在相似系数为 0.67 时聚在一起，以 0.763 为阈值，可将 21 个桦褐孔菌菌株划分为 6大类， FL、ELS、 MAFF4xx2、MAFF4xx6、CX01、JL01、CX02、JL02、JL03、JL04、JL05 聚为类群I,其中MAFF4xx2 MAFF4xx6亲缘关系最近，遗传相似系 数达到 0.882，即在遗传组成上有 88.2%是相似的； MAFF4xx1、 MAFF4xx0 MAFF420304 MA