瘢痕成纤维细胞钙网蛋白研究论文

1、瘢痕成纤维细胞钙网蛋白研究论文目的观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.970.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.430.12),差异有非常显著意义(P0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均有着

2、积极作用。 Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedin

3、HSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionI

4、nHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2+sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion. 【Keywords】HypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression 增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作为创伤及外科手术

5、后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的1，近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响2-5，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值6。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活性功能中的

6、作用。 1材料与方法 1.1组织标本 增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄1740岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间均在69个月之间。 1.2主要试剂及物品准备 羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DMEM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。 1.3成纤维细胞培养 手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3

7、次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，375%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。 1.4CRT免疫细胞化学染色 体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清3720min，抗CRT抗体37作用45min，HRP-兔抗羊IgG37反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。 1.5CRT原位ELISA检测7 选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100l接种

8、于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%TritonX-1004作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37、20min)、抗CRT抗体(37、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100l，作用30min后用50l1mol/L硫酸中止反应。ELISAreader上读取492nm的P值。 2结果 2.1成纤维细胞初代培养结果 在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，

9、2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。 2.2成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果 原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当

10、瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。转 此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。 2.3成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果 根据CRT免疫细胞化学染色结果，我们对第5代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的CRT表达值为1.430.12(A)，瘢痕成纤维细胞组为1.970.15(A)，二组间差异有非常著性意义(P0.01)。 3讨论 增生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活

11、化即继续旺盛增殖并分泌大量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造成的一种组织病理改变，有关瘢痕成纤维细胞为何异常活化一直是整形烧伤外科领域里重点探索的课题之一。转化生长因子1、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1和类胰岛素生长因子-1等在增生性瘢痕组织内的过度表达一直被认为是引起成纤维细胞异常活化不可忽视的因素，但越来越多实验研究表明瘢痕成纤维细胞自身生物学特性改变是触发其功能异常的关键8。我们通过对细胞内CRT的表达检测，进一步发现CRT不但在瘢痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明显高于正常皮肤成纤维细胞内水平。 CRT作为钙离子主要结合蛋白，早期研究认为CRT主要是通过影响细胞内钙离子的储

12、存与释放而影响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的研究结果表明CRT除上述作用外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接的介导和调节作用。1997年，Zhu等人9通过对B16细胞CRT表达的深入研究发现实细胞内的CRT分子常常与整合素粘附分子的链胞内区结合并成为双向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino等人5利用CRT缺乏而整合素表达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁移粘附研究，证实在正常培养条件下干细胞的迁移扩散能力很弱，而经转染CRT基因后，细胞的迁移粘附作用显著增强。因此，Coppolino认为细胞内CRT与整合素粘附分子直接参与细胞的信号传导、粘附、迁移扩散等生物学活性功

13、能。Tsai等10曾利用体外结缔组织收缩模型发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮肤成纤维细胞更强的迁移扩散能力，并认为其作用可能与细胞内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后研究工作阶段却发现在相同培养条件下增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞除有着较强迁移扩散能力外，还具有高表达1、1、2、3及4整合素粘附分子的特性11，从而提示瘢痕成纤维细胞的强迁移扩散能力与高表达整合素粘附分子有关；而从本实验对CRT在瘢痕成纤维细胞内的表达情况来看，细胞内其CRT表达并不属持续性表达，CRT的高表达期一般是在细胞的迁移扩散阶段，而当细胞融合后细胞内CRT表达甚少。但就与同一时期培养的正常皮肤成纤维细

14、胞相比，瘢痕成纤维细胞内的CRT表达则显得更为丰富。因此，结合我们以往的研究工作结果，我们认为：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的CRT、整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同作用的结果，其中积聚的肌动蛋白丝是其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的CRT及整合素粘附分子则是细胞与细胞外间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、释放及其信号传导等也有着重要的意义。 参考文献 1KrauseKH,MichalakM.Calreticulin.Cell,1997,88:439-443. 2TectorM,ZhangQ,SalterRD.Beta2

15、-microglobulinandcalnexincanindependentlypromotefoldinganddisulfidebondformationinclassIhistocompatiblityproteins.MolImmunol,1997,34:401-408. 3LiuH,BowesRC,van-de-WaterB,etal.EndoplasmicreticulumchaperonesGRP78andcalreticulinpreventoxidativestress,Ca2+disturbances,andcelldeathinrenalepithelialcells.

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17、iumsignallingandcelladhesion.Nature,1997,386:843-847. 6EggletonP,ReidKB,KishoreU,etal.Clinicalrelevanceofcalreticulininsystemiclupuserythematosus.Lupus,1997,6:564-571. 7WiniskA,FosterC.ICAM-1expressioninaspontaneouslytransformedhumankeratinocytecellline:Characterizationbyasimplecell-ELISAassay.JInve

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19、HataK,ToriiS,etal.Contractionpotencyofhypertrophicscar-derivedfibroblastsinaconnectivetissuemodel:invitroanalysisofwoundcontraction.AnnPlastSurg,1995,35:638-646. 11赵烨德，何清濂，纪徐淮，等.瘢痕成纤维细胞整合素表达实验研究.第二军医大学学报，1998，19：330-3327 1、最灵梦想是一个天真的词，实现梦想是个残酷的词。21.3.23.2.202101:0801:08:483月-2101:082、只有收获，才能检验耕耘的好处；

20、只有贡献，方可衡量人生的价值。二二一二二一年三月二日2021年3月2日星期二3、不要放弃，你要配的上自己的野心，也不要辜负了所受的苦难。01:083.2.202101:083.2.202101:0801:08:483.2.202101:083.2.20214、找一个理由，否认忧伤，笑容就会灿烂到无所不在。3.2.20213.2.202101:0801:0801:08:4801:08:485、成功与不成功之间有时距离很短只要后者再向前几步。三月 21星期二, 三月 2, 20213/2/20216、只要努力抬起你的双脚，胜利将属于你。1时8分1时8分2-3月-213.2.20217、青春如此华美

21、，却在烟火在散场。21.3.221.3.221.3.2。2021年3月2日星期二二二一二二一年三月二日8、真正没有资格谈明天的人，是那个不懂得珍惜今日的人。01:0801:08:483.2.2021星期二, 三月 2, 20211、你始终不属于我，属于我的只是我自己。21.3.23.2.202101:0801:08:483月-2101:082、一份信心，一份努力，一份成功；十分信心，十分努力，十分成功。二二一二二一年三月二日2021年3月2日星期二3、你是唯一的，你是十分独特的，你就是你生命中的第一名。01:083.2.202101:083.2.202101:0801:08:483.2.202101:083.2.20214、要跟成功