拟穴青蟹甲壳肽(Crustin)的免疫功能研究

1、拟穴青蟹甲壳肽（Crustin ）的免疫功能研究拟穴青蟹 (Scylla paramamosain),简称青蟹 , 是我国重要的经济蟹类之一,广泛分布于我国的东海和南海等海域。近年来, 伴随着蟹类养殖规模的扩大以及其集约化养殖的发展 , 各种养殖病害频发严重制约了蟹类养殖产业的发展。青蟹凭借其独特的先天性免疫系统, 在外界不良生存环境中有效地抵御外界病原菌的入侵 , 因而其先天免疫防御机制的研究备受关注。甲壳肽 (Crustin)是甲壳动物免疫系统的重要效应分子, 本研究我们从青蟹中鉴定了3 个甲壳肽基因 ,分别命名为 SpCrus3、SpCrus4 和 SpCrus5。当前文献报道将甲壳肽分

2、为5 类, 在 I 型甲壳肽中 , 信号肽序列和 WAP结构域之间含一个半胱氨酸富含区。通过对获得的SpCrus3 和 SpCrus4 序列进行分析 ,我们发现这两个分子均属于I 型甲壳肽 , 并且这两个基因的cDNA序列含有相同的5端。表达模式分析显示 :SpCrus3 和 SpCrus4主要在鳃中表达 ; 在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus4 上调表达 , 而 SpCrus3 下调表达。 虽然 SpCrus3 和SpCrus4 具有 66.06%的相似性 , 但 SpCrus4 的抗菌活性强于 SpCrus3。微生物结合实验表明SpCrus3和 SpCrus4对所有受试微生

3、物均具有结合活性。多糖结合实验表明这两个蛋白对细菌多糖如脂多糖(LPS) 、脂磷壁酸 (LTA) 和肽聚糖 (PGN)都具有结合活性 , 并且 SpCrus3和 SpCrus4 对 LPS和 LTA的结合活性强于PGN。此外 ,SpCrus4 对 LTA的结合活性强于SpCrus3, 这可能是这两个蛋白之间抗菌活性呈现显著差异的原因。凝集实验表明SpCrus4 对微生物的凝集活性强于SpCrus3, 这种增强的凝集活性可能有助于SpCrus4 表现出更强的抗菌活性。基于以上结果 , 我们提出了 SpCrus3 和 SpCrus4 参与青蟹抗菌免疫的模型 :SpCrus3 在健康的青蟹中高度表达

4、以保持低水平的抗菌活性 ; 当细菌感染青蟹时 , 诱导产生大量的 SpCrus4 表现出对细菌更强的抗菌活性。根据当前分类标准 ,II 型甲壳肽在 N端邻近信号肽区有一段较长的富含甘氨酸的疏水区域 (GRR)和一个半胱氨酸富含区 , 同时在 C 端含有一个 WAP结构域。GRR结构域是区分 I 型和 II型甲壳肽的主要标记基序, 并且一些研究表明含有 GRR的 II型甲壳肽比 I 型甲壳肽具有更广泛的抗菌谱。我们发现SpCrus5 序列的 C 端含有一个 GRR结构域 , 这与经典的 II型甲壳肽的含有 N 端 GRRs结构域不同。表达模式分析显示 :SpCrus5 主要在鳃中表达 ; 在副溶

5、血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus5 上调表达 , 表明 SpCrus5 可能参与抗菌免疫反应。 为了进一步阐明这种 C 端 GRR结构域是否影响SpCrus5 的功能 , 我们通过删除 GRR结构域获得了 GRR缺失突变体 (SpCrus5-GRR)。SpCrus5 成熟蛋白的抗菌活性强于SpCrus5-GRR,前者对革兰氏阴性菌的抗菌谱也广于后者 ;SpCrus5 蛋白对微生物细胞的结合活性和多糖结合活性强于SpCrus5-GRR;SpCrus5和 SpCrus5-GRR凝集所有受试的革兰氏阳性菌。上述实验表明 ,SpCrus5 对微生物多糖的结合活性以及对微生物的凝集活性有助于发挥其抗菌活性 , 并且其 C 端 GRR结构域能够增强 SpCrus5 的抗菌活性并拓宽其抗菌谱。虽然根据经典分类方法 ,SpCrus5 属于 I 型甲壳肽 , 但 SpCrus5 与大多数 II型甲壳肽具有高度相似性并且其功能与一些II 型甲壳肽相似 , 表明 SpCrus5更像一个非经典的 II型甲壳肽。综上所述 , 本研究对青蟹中3 个甲壳肽基因进行了表达模式及免疫功能研究 , 发现 SpCrus3、SpCrus4 和