拮抗菌和青枯菌无致病力突变株防控茄科作物青枯病的效应和机理研究

1、拮抗菌和青枯菌无致病力突变株防控茄科作物青枯病的效应和机理研究青枯病是一种主要的植物病害, 对农业生产造成了巨大的危害。青枯病的病原菌为茄科劳尔氏菌 (Ralstonia solanacearum),可腐生也可寄生 , 可在土壤中存活很长时间 , 是一种土壤习居菌。其传播途径多样 , 条件适宜时即迅速增殖 , 造成青枯病的爆发。 由于轮作、套种等耕种措施应用的受限, 化学防治对环境的污染且效果微弱, 生物防治因此日益受到人们的重视。青枯病的生物防治主要有利用无致病力青枯菌以及青枯菌的拮抗菌。使用抗性品种也是较好的防治策略, 但抗性品种的培育耗时长, 也需要消耗大量的人力物力 , 而利用植物疫苗

2、工程菌的刺激, 诱导植物自身产生系统抗性, 成为十分有潜力的防治方法。青枯菌致病性调控网络复杂, 其中 PhcA (phenotype conversion A)是该调控网络的核心因子。 PhcA可被青枯菌的胞外信号分子3- 羟基棕榈酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester,3-OH PAME)激活 , 正向调控胞外多糖EPS I (exopolysaccharides I)、胞外酶 Pme (pectin methylesterase,果胶甲酯酶 ) 的产生以及 AHL (acyl-homoserine lactone)介导的群体感应系统。另外 ,Phc

3、A 负向调控嗜铁素的产生、细胞运动及对环境的耐受性。编码基因phcA 位于青枯菌的染色体上 , 当青枯菌在植物维管束中迅速增殖时,PhcA 的活性很高并开启青枯菌相关基因的表达, 从而促进青枯菌的大量增殖。hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity)基因簇也是一个重要的与致病相关的基因簇 , 存在于青枯菌的大质粒上。 青枯菌的 hp 基因簇包含多达23 个基因 , 主要编码青枯菌的关键致病因子型分泌系统。在 hrp 基因簇两侧还分布有与 hrp 基因有关的调控基因 ( 如植物信号调控相关基因 prh) 及分泌的效应蛋白编码基因 ( 如 popA

4、)。本论文通过基因工程的方法 ,敲除 Ralstoniasolanacearum ZJ3721 的 phcA 和 hrp 基因 , 构建了番茄无致病力青枯菌菌株 , 研究其诱导植物产生系统抗性以及防治番茄青枯病的能力, 及作为植物疫苗工程菌广泛应用的可能性。研究结果如下： (1) 解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)S20对茄青枯病的防控以实验室保存菌株 B. amyloliquefaciensS20为生防菌 , 通过盆栽试验证明其对茄青枯病有较好的防控效果 , 与有机肥联合施用时防效可达70.7%。试验结果表明有机肥可提高 S20 在土壤中的存活能力 ,

5、增加其在植株根际土中的定殖。高效液相色谱及液质联用分析表明 ,S20 产生的主要抑菌物质为 Iturin家族的物质有 C13Iturin A、C14Iturin A、C15 Iturin A 和 C16Iturin A。(2)phcA-突变株和 hrp- 突变株的构建本研究以R. solanacearum ZJ3721为材料 , 通过同源片段的融合、重组 , 以 sacB 作为反向筛选标记基因 , 经过两轮重组和筛选 , 最终获得了 R. solanacearum ZJ3721 phcA-突变株和 hrp- 突变株。其中 phcA-突变株是在 R. solanacearum ZJ3721菌株

6、phcA 基因阅读框内缺失了约 700bp 的 DNA片段 ,hrp- 突变株是在 R. solanacearumZJ3721 菌株 Hrp 基因簇内缺失了约2500bp 的 DNA片段。盆栽试验表明两个突变株都丧失了对番茄的致病能力。(3) phcA- 突变株和 hrp- 突变株的特性 phcA-突变株和 hrp- 突变株在生长和碳源代谢上也与野生菌株表现出很大的不同。在营养丰富的条件下, 突变株在对数生长期的中后期生长速度明显慢于野生菌株, 并在稳定期时菌体浓度显著小于野生菌株。phcA-突变株表现出了对糊精、 D-果糖和 D-葡萄糖酸较快的利用能力； phcA-突变株和 hrp- 突变株

7、都表现出了对 -D- 葡萄糖、 D-甘露醇和蔗糖等23 种碳源较快的利用能力；但突变株丧失了利用 - 氨基丁酸的能力。 phcA-突变株和 hrp-突变株的多种致病基因的表达都受到了抑制。葡聚糖内切酶基因 (egl) 、与致病相关的转录调控基因(xpsR) 、胞外蛋白基因 (tek) 和分泌胞外多糖的内膜蛋白基因(epsE) 的表达都受到了95%以上的抑制。(3) phcA- 突变株对番茄青枯病的防治效果盆栽试验检测了 phcA-突变株作为生防菌株对番茄青枯病的防治效果。结果显示 , 同时接种病原菌和 phcA-突变株 , 防效微弱 , 只能延缓发病一天左右；但提前 3 天接种生防菌表现出显著

8、防效 ,25 天后防效可达 90%。对番茄根际土中病原菌和生防菌数量的测定显示 , 提前 3 天接种生防菌比同时接种更能有效抑制番茄根际病原菌数量, 接种 8 天后病原菌数量与对照相比下降了1.4 个数量级。提前 3 天接种生防菌也更能有效抑制番茄植株茎中病原菌数量, 并增加自身在茎内的定殖数量。 (4) phcA- 突变株诱导番茄的系统抗性通过水培试验考察了phcA突变株对番茄系统抗性的诱导作用, 结果表明 , 接种 3 天后 ,phcA- 突变株对番茄水杨酸途径 (salicylic acid, SA)、茉莉酸途径 (jasmonic acid, JA)和乙烯信号途径 (ethylene,

9、 ET)的基因都有不同程度的诱导。而且对于 SA途径的 PR-la 和 gluA 基因 ,phcA- 突变株的诱导表达量甚至比野生菌株的诱导表达量还高, 分别是野生菌株诱导表达量的66 倍和 7.5 倍。但该诱导效果在 15 天后显著下降。水培试验条件下 R. solanacearum ZJ3721野生菌株和 phcA-突变株在番茄根表的定殖数量显示 , 野生菌株的数量在15 天内比较稳定 , 而 phcA- 突变株的数量在 10 天内较稳定 , 到 15 天时显著下降。 (5) phcA- 突变株和 hrp 突变株也能诱导烟草植株的系统抗性研究结果表明, 番茄青枯菌 phcA-突变株和 hr

10、p 突变株也能有效诱导烟草中茉莉酸(JA) 信号途径和水杨酸 (SA) 信号途径的抗性基因的表达。而且 , 青枯菌突变株对烟草系统抗性的诱导效果显著强于试验的生防菌株Bacillus amyloliquefaciensSQR-7和 Pseudomonas brassicacearum J12. 生防菌株 Bacillus amyloliquefaciens SQR-7不能诱导烟草植株的系统抗性, 而Pseudomonas brassicacearum J12 的诱导能力很弱。 (6) phcA- 突变株在土壤中的定殖研究表明 , 相比于单独接种phcA-, 接种的同时使用猪粪堆肥和发酵菜粕组成的有机肥对phcA-突变株在土