GST表达系统的PROTOCOL

1、P4自配材料 ：（接上）凝血酶 ：将 500 裂解单位的冷冻干燥过的牛凝血酶 （7500 单位 /毫克蛋白 ）0.5mL 于 40 oC 预 冷的IxPBS中。缓慢振荡使凝血酶溶解。 在22oc,16h,10mM谷胱甘肽，50mMTris-HCI,pH8.0 的条件下，一单位的裂解酶可裂解90%的100卩g的测试融合蛋白。为保持其活性，应将凝血酶溶液分成小等份于 -70oC 保存（牛凝血酶分子量约为37kDa ）安全性警告及预防措施 警告：本实验器材只用于科研，不建议用于人类或动物的疾病诊断，不可用于人类或动物的体内或体外研究。所有化学用品都有潜在毒性，只有经过实验技术训练或熟悉良好实验实践原

2、则的人才 可操作使用该产品。使用时需穿戴合适的保护服，如实验工作服、安全眼镜、手套等。使用 时应小心避免化学用品接触眼和皮肤，一旦接触到则应立即用水清洗（详见材料安全使用 页）。警告 ：该套器材含有甲酰胺，凝胶试剂中可能含有丙烯酰胺，是一种神经毒素，并怀 疑有致癌性。 在合理使用过程中需要用到乙醇， 是一种易燃液体， 为安全操作和使用这些材 料请遵循工业生产上的安全资料使用条例。P5自配材料 ：（接上）2xYTA 培养基 ：胰蛋白胨 16g/I 酵母提取物 10g/I NaCI 5g/I将上述材料溶解于 900mL蒸馏水中，用NaOH调pH致7.0后配成1升溶液。高压灭菌 20分钟。介质冷却后

3、无菌加入 1mL100mg/mL的氨苄西林储存液，（使终浓度达到100卩g/mL） 加入 12-15g 琼脂以制成固体培养基。20% Triton X -0020% Triton X-100 -v/v in 1x PBS 器材 ： 用于 SDSPAGE 的试剂，仪器和凝胶 使用指导谷胱甘肽交联琼脂糖 4B用于谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽依赖的蛋白及谷胱甘肽重组 衍生物，如用 pGEX系列表达载体得到的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白（GST）的快速，单步纯化。GST融合蛋白可用谷胱甘肽交联琼脂糖4B从细菌溶胞产物中直接纯化得到。蛋白质需要在温和及未失活的状态下洗脱以保持其功能和抗原性。所要的蛋白的裂

4、解可用一特异位点蛋白酶从 GST 上分离得到，该蛋白的识别序列紧靠 pGEX 质粒的多克隆位点上游。 谷 胱甘肽交联琼脂糖 4B （27-4574-01 ）可被证明在结合重组 GST 中是有用的。P6操作规程指导 ：根据下述操作规程使用谷胱甘肽交联琼脂糖 4B （27-4574-01 ）可方便地纯化少至 80 卩g多至400mg的GST融合蛋白。融合蛋白的产量会有很大程度的变化并受融合蛋白的性质、宿主细胞，培养条件等 的影响。其产量可由 1-3mg/L升至10mg/L （2）。以2.5mg/L为平均产量，表1可用来估计 需要的培养量。注：试剂的剂量要求取决于8mg每毫升脱水凝胶的重组 GST的

5、结合能力。该结合能力是谷胱甘肽交联琼脂糖4B （27-4574-01 ）的最小结合能力。要得到精确的结合能力请参考瓶上的标签。P7表1不同蛋白产量所需试剂的体积组分80mg16mg1.6mg80卩g培养（基）体积20L4L400mL20mL超声破碎体积1000mL200mL20mL1mL谷胱甘肽交联琼脂糖床体积* 10mL2mL200 卩 L10卩L1xPBS*100mL20mL2mL100 卩 L谷胱甘肽洗脱缓冲液10mL2mL200 卩 L10卩L*：为获得期望的床体积，可用由操作1中准备的50%的谷胱甘肽交联琼脂糖浆液使用两次（即1mL50%谷胱甘肽交联琼脂糖浆液为0.5床体积）* :该

6、体积指“每次洗脱”。需要洗脱3次P8 50%谷胱甘肽交联琼脂糖 4B匀浆的制备谷胱甘肽交联琼脂糖 4B可用于以pGEX系列为表达载体的谷胱甘肽S-转移酶或重组GST融合蛋白产品的批量纯化或柱纯化。当凝胶平衡时，可被转移至合适的层析柱中，如果要求的话。空的一次性 PD-10柱，其Amersham Bioscienee 号为17-0435-01，总容量（凝胶以及样本）约为13mL关于谷胱甘肽S-转移酶蛋白的柱纯化细节请参照操作步骤31.1参照表1可根据您使用需求来决定谷胱甘肽交联琼脂糖4B的床体积。所提供的谷胱甘肽交联琼脂糖 4B约为75%的浆液。下列步骤可用于配制50%的匀浆1.2轻轻晃动谷胱甘

7、肽交联琼脂糖4B使凝胶重新悬浮。1.3用吸管将足够使用量的匀浆转至合适的容器/试管中，按要求每毫升床体积配制1.33mL原始谷胱甘肽交联琼脂糖 4B匀浆。每mL干凝胶可结合至少 8mg的重组GST， 要得到精确结合能力请参照瓶上标签。P91.4 500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，小心倒去上层液体1.5用10mL4 C的1xPBS （见自配材料）冲洗由每1.33mL初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B配制的谷胱甘肽交联琼脂糖4B，上下翻转以混匀。注谷胱甘肽交联琼脂糖 4B必须用1xPBS彻底冲洗以除去20%的乙醇贮存液。乙 醇液由剩余将会影响随后的产物。1.6500xg离心5分钟使凝胶沉淀，去上层液体。1

8、.7向由每1.33初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B配制的匀浆中加入 1mL1xPBS,50%的匀浆就制成了，在随后的吸取步骤前混合均匀.注:用1xPBS平衡的谷胱甘肽交联琼脂糖4B可在4C存放一个约月.P10 批量纯化谷胱甘肽 S-转移酶蛋白2.1向每100mL超声破碎的细菌（附录3）中加入2mL用1xPBS（操作步骤1）平衡的50% 的谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 匀浆 .2.2 用温和的激动剂室培育 30 分钟 注：这一步中，吸附了混合蛋白的凝胶可填充于免洗脱柱中而易于冲洗和洗脱， 如果使用免洗柱，请参考操作规程3 中冲洗和洗脱的说明2.3 将混悬液 500xg 离心 5 分钟使凝胶沉淀，弃上清。

9、注：大部分上清液可被抛弃，但可保留部分样品用 SDS-PAGE 或 CDNB 分析鉴定（参照 GST 检测模型 27-4590-01 ）以估记凝胶结合率2.4用10倍床体积*的IxPBS洗谷胱甘肽交联琼脂糖4B小珠2.5 500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，弃洗液2.6 重复洗 2 次使洗的次数累计达到三次 注：用谷胱甘肽洗脱缓冲液可直接将结合在凝胶上的蛋白洗脱下来（参照“自配材料”）。如果需要的话，GST融合蛋白可能会裂解，裂解后的凝血酶、凝血因子Xa或PreScissionTM蛋白酶仍然结合在凝胶上而感兴趣的蛋白从GST上游离出来。如果pGEX的构建中包含有凝血酶的识别序列请参照附录4。*床

10、体积相当于0.5X的50%的谷胱甘肽交联琼脂糖匀浆体积。P11洗脱2.7 按每毫升床体积谷胱甘肽交联琼脂糖 4B1mL 的量向沉淀凝胶中加入谷胱甘肽洗脱 缓冲液（参照“自配材料” ）2.8轻轻晃动使凝胶重新悬浮，室温（22-25C）培养10分钟使融合蛋白从凝胶中游离 出来2.9 500xg 离心 5分钟使凝胶沉淀，将上请转至一洁净离心管中2.10洗脱洗脱及离心步骤再重复两次，将三次洗脱物集中起来注：按此洗脱步骤，会有大量蛋白仍会结合在凝胶上，因此步同蛋白融合的洗脱 时间及体积会有很大的变化。也许需要额外的洗脱。洗脱物可用SDS-PAGE 或 CDNB检测GST蛋白（GST测定模块，27-459

11、0-01 ）注：融合蛋白的产量可由 280nm处的吸光度估量，对GST亲和标记，1A280沁0.5mg/ml注：蛋白质的产量同样可用标准显色方法测定（如：Lowry 、 BCA、 Braford 等）如果使用Lowry或BCA类似的方法，样品必须用 2000体积的1xPBS透析以除去谷胱 甘肽，后者会干扰蛋白质的测量，而 Braford 法可在谷胱甘肽存在的条件下使用P12 谷胱甘肽S-转移酶的柱纯化平衡3.1 每次纯化时都要将免洗柱的顶盖移开并将柱子直立置于合适的架子或夹子上3.2参照表1，根据使用情况来决定谷胱甘肽交联琼脂糖4B床体积3.3轻轻晃动谷胱甘肽交联琼脂糖4B使凝胶重新悬浮3.4

12、根据要求向酶 mL床体积中用移管加入 1.33mL初始的谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆3.5轻拍柱子除去凝胶床中存在的气泡，使沉降完成。3.6 移去底盖，以备后用。 （由于柱子缺少一个可重复利用的底盖，因此降封底折断。 Parafilm TM 在其后的步骤中可代替底盖）3.7用10mL4 C的IxPBS冲洗由每1.33初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆配制的谷胱甘肽交联琼脂糖4B,将底盖重新放置好或用Parafilm包裹柱子以避免凝胶干燥。注：谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 必须用 1xPBS 彻底洗净以除去 20% 乙醇贮存液。残余 乙醇会对随后的步骤产生影响。注：用IxPBS平衡的谷胱甘肽交联琼脂糖4B

13、可在4C保存一个月P13结合3.8 用吸管将超声破碎的细菌涂于柱上的凝胶上， 此时谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 柱子已 经干燥并已平衡过注：如果需要的话在将超声破碎物涂于柱上前可先用0.45卩m的滤孔过滤3.9 将 Parafilm 底盖移去，使破碎物能顺利流过。 注：大部分的流过物可被丢弃，但可从中取样做 SDS-PAGE 或 CDNB 测定（参照 GST 检测模块， 27-4590-01 ）以估计凝胶结合效率3.10 用 10 倍量的 1xPBS 洗柱子。将柱子干燥，重复洗两次，使洗的次数达到三次 注：用谷胱甘肽洗脱缓冲液可直接将结合在凝胶上的蛋白洗脱下来（参照“自配材料”）。如果需要的话，G

14、ST融合蛋白可能会裂解，裂解后的凝血酶、凝血因子Xa或 PreScissionTM 蛋白酶仍然结合在凝胶上而感兴趣的蛋白从 GST 上游离出来。如果 pGEX 的构建中包含有凝血酶的识别序列请参照附录 4。 GST 基因融合蛋白系统手册中 有详细步骤。参见 Amersham BioSciences 文件 18-1157-583.11 当有结合蛋白柱洗完并干燥后，将底盖重新安置好或由Parafilm 包好P14洗脱3.12 向每 mL 床体积中加入 1mL 谷胱甘肽洗脱缓冲液将融合蛋白洗脱，将柱室温下放 置 10 分钟以洗脱融合蛋白3.13 将底盖或 Parafilm 移去，将洗脱物收集起来，其

15、中包含有融合蛋白3.14 重复洗脱及收集步骤两次，将三次洗脱物收集起来注：按此洗脱步骤，会有大量蛋白仍会结合在凝胶上，因此步同蛋白融合的洗脱 时间及体积会有很大的变化。也许需要额外的洗脱。洗脱物可用SDS-PAGE 或 CDNB检测 GST 蛋白（ GST 测定模块， 27-4590-01 ）注：融合蛋白的产量可由280nm处的吸光度估量，对GST亲和标记，1A280沁0.5mg/ml注：蛋白质的产量同样可用标准显色方法测定（如：Lowry 、 BCA、 Braford 等）如果使用 Lowry 或 BCA 类似的方法，样品不必须用 2000 体积的 1xPBS 透析以除去谷 胱甘肽，后者会干

16、扰蛋白质的测量，而 Braford 法可在谷胱甘肽存在的条件下使用P15附录 1谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 的特点配体浓度：每mL凝胶7.15卩mol谷胱甘肽容量 ：每毫升干燥凝胶，可容纳多于 8mg 重组 GST珠式样：球形，湿直径 45-165卩m隔离臂 ：12 原子（ 10 个碳原子）化学稳定性：室温下谷胱甘肽交联琼脂糖 4B与0.1M柠檬酸盐（pH4.0）, 0.1M NaOH , 70%乙醇或 6M 盐酸胍接触 2 小时后并未检测到显著的容量损失。与 1%SDS 接触 14 天后也未见结合能力的显著损失。最大工作压 ： 7.845kpa,0.075 巴最大容积流速：HR16/10柱（5

17、cm高）室温下水溶性缓冲液，2.5ml/min （运行中）最大线形流速75cm/h （运行中）P16附录 2 谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 的再生1 .用两倍床体积的 0.1MtrisHCl 和 0.5MnaCl,pH8.5 冲洗凝胶2. 用两倍床体积的 0.1M 醋酸钠 +0.5MnaCl,pH4.5 冲洗凝胶3. 重复上述步骤 3-4次，使缓冲液交换循环次数达到 4-5次4. 用3-5倍床体积的IxPBS重新平衡 如果凝胶结合能力出现下降，可能是由于一些沉淀的，变性的或非特性的结合的蛋白引起的。为除去沉淀的或变性的蛋白，可用 2 倍床体积的 6M 盐酸胍冲洗凝胶，并立即用 5 倍床体积的1xP

18、BS冲洗为除去疏水性结合物质， 可用 3-4倍床体积的 70%的乙醇或 2倍床体积的非离子洗涤 剂（浓度为0.1% ）洗凝胶，并立即用5倍床体积的1xPBS洗凝胶当需要长期贮藏时 （1 个月）建议按下列额外进行冲洗。1. 用10倍床体积的1xPBS冲洗凝胶两次2. 用 70%的乙醇洗3.4 C贮存4.使用前用1xPBS重新平衡。P17附录 3 广域细菌超声破碎的准备pGEX 载体含有 lacIq 基因，故用于质粒增殖或融合蛋白表达的宿主不需要由特殊的要 求。而大肠杆菌 BL21F -,ompT,bsdS（rB-,mB-）,gal（ 3， 4）携带有 pGEX 载体，该菌株可 推荐用于GST融合

19、蛋白的表达。BL21转化不是很好，因此替代菌株（如JM105）可推荐用于质粒的保存。在大规模（量程）纯化前，应先测试培养基种蛋白的表达情况，或者可以做一些 小的试验性的实验以确定蛋白表达的最佳条件。融合蛋白的表达可在细菌生长或诱导过程中用SDS-PAGE或根据GST检测模块（27-4590-01 ）测量GST活性的方法来进行 监测。在实验过程中每个关键步骤中都应保留一些小样本以用于对纯化方法的分析。1 使用以含有重组 pGEX 质粒的大肠杆菌单一菌落在 2xYTA 培养基中培养 2100ml。（参见未供给材料）。2. 37 C下，有力摇动下培养 1215小时3将培养基用预热的 2xYTA 的培

20、养基按 1： 100的比例稀释并分装到大小合适的 烧瓶中2030 C条件下摇晃培养直至 A600值达到0.52注：为保证足够通气量，每个烧瓶只加入 20-25%容量的量。（如 100ml 烧瓶中加 入 20ml ）注：选择最佳诱导生长温度喝 A600 值，不同融合蛋白见的差距很大。P184. 加入100mMIPTG,使终浓度为 0.1mM并继续培养 26小时5. 将培养液转移至合适离心管或离心瓶中，7700xg（如贝克曼JA20 8000rpm ）4 C 离心 10 分钟，使细胞沉淀。6 弃上清，使沉淀干燥，置于冰上。7.用吸管将细胞沉淀悬浮于冰浴过的IxPBS （每ml培养基50卩I）8 根

21、据悬浮体积置于合适（专用）超声破碎仪上分裂悬浮，细胞在冰上短时超声 裂解，保留超声破碎少量样品用于 SDS-PAGE 分析。注：细胞破裂可将悬浮液部分清洗来显示，或用显微检查进行检测，同时应避免起泡，以防融合蛋白变性，过度超声破碎会导致宿主蛋白和GST 融合蛋白共同纯化出来。注：在此步中 GST 活性可用 CDNB 分析进行监测。这是项有用的筛选技术并能提供蛋白表达已经足够的证明从而可用于修正随后的步骤（见GST 监测模块，27-4590-01 ）9.力口 20%的Triton X-100使种浓度为1%轻轻混合30分钟使融合蛋白溶解。10.4C, 12000 x g离心10分钟（如1000rp

22、m，贝克曼JA20）,将上清液转至洁净 容器中，保留上清液和细胞沉淀碎片的小样本做 SDS-PAGE 分析，这样样本可用于鉴 定含融合蛋白的组分。11.按操作规程 2 或操作规程 3 继续操作。P19GST 融合蛋白的凝血酶裂解在下面的步骤中样品要在不同时间点取样并做 SDS-PAGE 分析以确定其产量，纯 度及凝血酶消化程度。不同的 GST 融合蛋白完全消化所需凝血酶的量，培养温度及时 间也应有相应的变化。总的来说， 以 10裂解蛋白单位 /毫克融合蛋白的比要完全裂解需要过夜处理。需做试验性实验以确定不同种类融合蛋白裂解的最佳条件。某些应用中，（裂解后）应利用层析法将样品中的凝血酶除去。洗脱

23、后 GST 融合蛋白的裂解 在多数情况下，所感兴趣的蛋白的伴随融合蛋白也保留有功能活性，故可将连有 GST的完整蛋白做功能测试。如果必须将GST亲和尾巴除去，含有凝血酶识别位点的融合蛋白可直接按下列步骤在溶液中裂解：1. 批量纯化或柱纯化洗脱后，向每毫克融合蛋白中加入10卩L的凝血酶溶液（10个单位，“自配材料”来准备）2. 轻轻混合，并在室温下（22-25 C）培育2-16小时。3 ？P13连接于块基质上的融合蛋白的裂解1按下准备凝血酶反应物：每毫升谷胱甘肽交联琼脂糖床体积中将50卩L重悬凝血酶（按“自配材料”所描述地去准备）和 950卩L1xPBS混合起来。2.向由操作规程 2 得到地 谷

24、胱甘肽交联琼脂糖小球中加入凝血酶反应混合物，轻微旋 转混合后室温下摇动匀浆 2-16小时3. 混悬液 500xg 离心 5 分钟使交联琼脂糖珠沉淀下来GST 仍结合4. 将洗脱物小心转移至一洁净试管中保存，其中含有所感兴趣的蛋白，而 在凝胶上。连接于柱基质上的融和蛋白的裂解1.按上制备凝血酶反应混合物2.将底盖重置于按操作规程 3 洗的柱上（或用 Parafilm 包裹），加入凝血酶反应混合物3. 将底盖或 Parafilm 从柱上出去使凝血酶反应混合物进入谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 床， 当液体从柱底流出时，盖上底盖或用 Parafilm 包好并使柱子于室温静置 2-16 小时4. 培育后将底

25、盖或 Parafilm 移去并用一洁净试管收集洗脱物，向每毫升谷胱甘肽 4B 床 体积中加入 0.5mL ，1xPBS 并收集于含有洗脱物的同一试管中， 其中含有所需蛋白， 而 GST 仍旧结合于凝胶上。P21P22疑问：无法从细菌超声破碎的SDS PAGE 凝胶考马斯染色中检测到蛋白可能原因 /解决方法1.优化表达条件表达条件的优化可显著提高产量。请对菌株、介质条件、培养温度及诱导条件对融 合蛋白产量的 影响进行研究，不同融合蛋白的精确条件会有很大的差别2.检查 DNA 序列将在 pPGE 载体中合适翻译框架中的 蛋白质编码 DNA 序列克隆出来是非常必要的。 克隆序列结合处用 5?pGEX

26、 编码引物（ 27-1410-01 ）和 3?pGEX 编码引物来证明插入序 列和 GST 序列都在框架中。3. 用 SDS-PAGE 分析一过夜培养的小样本。总的来说，当5-10卩L已诱导的A600约为1.0的培养物还在凝胶上时，高表达蛋白 可很容易地由考马斯染色显示出来。 分别用来转化的大肠杆菌宿主细胞和由亲代 pGEX 载体转化的细胞平行跑胶以作为阳性和阴性控制。融合蛋白在整个细胞制备过程中存 在而在超声破碎后不存在则预示着存在有包涵体（见下）4. 隐藏蛋白 免疫印迹法可用于蛋白的表达， 一些融合蛋白在 SDS-PAGE 中可被一些具有相似分子 量大小的细菌蛋白掩盖起来。在这种情况下可用

27、免疫印迹法检出融合蛋白，按上所示，将诱导细胞跑SDS-PAGE,并将蛋白转移至硝酸纤维素或PVDF膜上，用抗GST抗体，检测融合蛋白（参见 GST 检测模块； 27-4590-01 ）P23问题：大部分蛋白存在于超声破碎后的沉淀物中可能原因 /解决方法在细菌超声破碎制备中收集到的 SDS-PAGE 分析样本可能暗示这大部分 GST 融合 蛋白都留在了超声破碎后沉淀中，可能原因及解决方法如下所示：1 超声破碎不足，细胞破裂可由部分悬浮清除来说明或由显微观察检测到，在超声破碎前加入溶菌酶可能会使结果有所改观（ 0.1 体积的 10mg/ml 的溶菌酶溶于25Mm Tris-Hcl 中， pH8.0

28、 ）。避免起泡，这可能会引起融合蛋白变性，过度 超声破碎可能会使宿主细胞蛋白与 GST 融合蛋白一起被纯化出来。2 融合蛋白可能会不溶（包涵体） 如果在超声破碎后离心所得可溶物中找不到足够蛋白，则有必要改变一下生长 培养条件。诱导过程中降低温度可使融合蛋白溶解度有显著提高，生长培养实验温度 应在20-30 C范围内。降低 IPTG 的浓度至 0.1mM 以下改变诱导水平改变诱导时间在短时间内诱导短时间内高浓度细胞诱导增加空气流通，高氧气转移能放置包涵体形成可将上述处理结合进行，其它条件（改变）则可根据经验及不同融合蛋白决定采 用。如果上述技术仍无法使可融合表达有显著提高，则可用一般变性剂由包涵

29、体溶解 得到，这些变性剂诸如 4 8M尿素，去污剂，碱性 pH （ 9），有机溶剂（8, 9）及N 十二烷基肌氨酸（ Sarkosyl） （ 10， 11）其它可变的影响溶解度的因素还有时间、温度 离子强度、蛋白变性比及硫醇试剂的存在等。回顾时可参照参考资料5.8.9 及 12溶解后，蛋白质必须从合适（构象）折叠以恢复活性。可由裂解稀释或凝胶过滤 以除去变性， 使蛋白重新折叠并形成正确的分子内缔合， 折叠中决定性的参数包括 pH， 硫醇试剂的存在及去变性速度。一旦重折叠完成，可由离子交换层析，凝胶过滤层析 及亲和层析对蛋白进行纯化。变性的融合蛋白可纯化至某一程度，在GST 融合蛋白形成包涵体的

30、一些情况下，在 2-3M 盐酸胍或尿素及最多 2的吐温 20 存在下，（融合蛋 白的）溶解和结合到谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 可（顺利）完成。P25 疑问：融合蛋白无法结合于谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 上。 1 结构改变由检测母本 PGEX 的 GST 结合能力，制备合母本 PGEX 质粒的细胞超声破碎片并 检查其与凝胶结合能力，如果由母本质粒得到的GST （与凝胶）有高度亲和力，说明融合蛋白那部分改变了GST的构象，从而降低其亲和力，将结合温度降至4C,并减少冲洗次数可得到足够 /合适的结果。2超声破碎使融合蛋白变性。过量超声破碎会使融合蛋白变性并使其难以结合于谷胱甘肽交联琼脂糖4B 上，因此在

31、细胞裂解中采用温和的条件。3细胞裂解前加入 TT 在细胞裂解前加入终浓度为 5mM 的 DTT 可显著提高某些 GST 融合蛋白与谷胱甘 肽交联琼脂糖 4B 的 结合能力。4使用新鲜的谷胱甘肽交联琼脂糖4B如果谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 已使用多次，则有必要使用新鲜的凝胶，细节参见附 录 2。P26问题 1 融合蛋白不能从谷胱甘肽交联琼脂糖 4B 上有效洗脱可能原因 /解决方法1洗脱时间不够某些情况下，室温或 4C过夜洗脱效率最高2洗脱缓冲液不够增加洗脱缓冲液的体积对于超过2X 107道尔顿分子量（蛋白）谷胱甘肽交联琼脂糖 4B可作为凝胶过滤介 质而起作用，小（分子量）蛋白（尤其是那些被特异点蛋白酶裂解后游离出来的蛋白 需要大洗脱体积，在这种情况下，应予使用批量纯化（参见操作规程2）由大体积洗脱的蛋白应由超滤进行浓缩3谷胱甘肽不足增加洗脱缓冲液终谷胱甘肽的浓度。 一般的操作规程中用 5mM 谷胱甘肽进行洗脱。 注意， 在根据说明溶解时， 洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度为 10mM ，而这浓度在大多情 况下都已足够而其他降低（浓度）的谷胱甘肽需另制，如果谷胱甘肽浓度显著上升至 15mM ，必须提高缓冲液浓度，以保证合适的 pH 值（ 14）4低离子浓度提高洗脱缓冲液的离子强度，向洗脱缓冲液中加入0.1 0.2M 的 NaCl 可改