纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用

1、纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 学校代号： 10532 学 号： S08111007 密 级： 湖南大学硕士学位论文 纳米材料及生物活性酶在生物传感器 中的应用 l 学位申请人姓名： 毯 蕴 导师姓名及职称： 毖瞳基数援 培养单位： 化堂丝王堂院 专业名称： 盆抚丝堂 论文提交日期： 2Q!生主旦2垒旦 论文答辩日期： 2Q!生三旦2墨旦 答辩委员会主席： 蕴健匪数援 The ofNanostructured Materialsand forthe Application Enzyme ConstructionofElectrochemicalBisensors ZHANGLi fo

2、r the BS InnerMongoliaUniversityNationalities 2008 Athesissubmittedin satisfactionofthe partial forthe of Requirementsdegree MasterofScience AnalyticalChemistry inthe GraduateSchool of Hunan University Supervisor ProfessorZHANG Xiaobing May,2011 研 集 已 留 阅 检 硕士学位论文 矗日 ：乏 在电化学生物传感器的研究中，纳米材料一直受到广大研究者的青

3、睐。纳米 材料具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，因而具备 特殊的磁学、光学、电学和催化活性等特性，在纳米电子设备、纳米材料传感器 以及催化剂等方面得到了较广泛的应用。纳米材料巨大的比表面积能显著提高生 物活性酶的负载量，将纳米材料应用于生物传感器可以显著提高传感器的性能， 所以纳米复合材料因其自身优点及其协同效应而越来越得到人们的重视。具体研 究内容如下： 1 以碳纳米管为载体，通过种子生长法制备了碳纳米管钯纳米颗粒复合物， 用于构建过氧化氢传感器。利用扫描电镜对碳纳米管钯纳米材料复合物的形貌进 行了表征，该纳米复合材料对过氧化氢具有良好的电化学选择性和催化特性，电 l

4、08 化学响应信号稳定，线性范围从l107M510之M，检测下限为05xM 第2 章 。 2 利用微孔聚碳酸酯膜 PC 模板法，首次制成了具有高度有序，排列规则 的镍纳米线阵列。首先将聚碳酸酯膜 PC 模板固定在电极上，采用恒电位沉积法， 使镍的单体进入模板微孔中，从而制成了镍纳米线阵列电极并用于葡萄糖的检测。 利用透射电镜 TEM 和扫描电镜 SEM 对镍纳米线阵列的形貌进行了表征。镍纳米 线阵列电极具有较多的电化学活性反应位点，在+055V下，01M的NaOH中 对葡萄糖具有较强的电催化能力，此外，电极具有较低的检测下限01 gM SN mM。1 3 ，较高的灵敏度1043 cm也和较宽的

5、线性范围，更重要的是，该电极对 gA 葡萄糖具有很好的选择性，对共存的干扰物质如抗坏血酸和尿素无响应 第3章 。 3 制备了一种基于羟基磷灰石壳聚糖复合体系的新型酪氨酸酶生物传感 器，并用于酚类化合物检测。利用扫描电镜 SEM 对羟基磷灰石的形貌进行了表 征。采用循环伏安法和电化学交流阻抗法对酪氨酸酶电化学生物传感器的性能进 行了表征。并对实验条件进行了优化，包括pH值，电位和实验温度。该修饰电 1l03 mM_1 极具有较宽的线性范围和高的灵敏度 21 gA em-2 ，响应快速，检测 分别为316，131和352。实验结果表明，该纳米材料复合膜作为酪氨酸酶良好 的载体，能够较好的保持其生物

6、活性，表现出良好的重现性 第4章 。 关键词：电化学传感器；碳纳米管；镍纳米线阵列；羟基磷灰石；酪氨酸酶 Il 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 Abstract Researchersmoreandmore pay attentiontonanomaterialsinthe of study electrochemicalbiosensorsWith smallsize unique effect，surface effect，quantum size materialsare effect，macroscopicquantumtunnelingeffect，nanostructur

7、ed attractiveinthe ofbiosensorsduetotheirnovel developement optical，electrical， and electrocatalytic ofthe biocompatiblepropertiesThe performance resulting biosensorscould be withthe of greatlyimproved application details aredescribedasfollows： CNTs anew kindof carbonmaterial represent promising ove

8、rthe pastyears owing tothe electrical suchas surface-to-volume unique propertieshigh chemical ratio，high and afastelectron-transfer stability theintroductionof rateWith Palladium CNTsPd film showed nano。particles，the between particlemultilayersystem synergy CNTs andPd withthe ofredox particle signif

9、icant duetothe improvement activity excellentelectron-transfer ofCNTsandPd CNTsPd ability particleThe particle modified carbonelectrodeallowed glassy low detectionof potential hydrogen with andfast peroxide timeThebiosensorexhibitedawide highsensitivityresponse linear to x x response peroxide from1

10、l0。7MtO5102Mwitha hydrogen ranging high limitofdetectionwasdownto x sensitivity，the 05 10唱M SN 3 in2 chapter ANinanowirewherefirst in arrays synthesizedbyelectrodeposition nanopore hasbeen forthedetectionof polycarbonate PC membrane developed glucoseThe size-controlledandunifoITn Ninanowirewere exam

11、ined arrays bytransmission electron electron microscope TEM and Ni scanning nanowire electrodeexhibiteda electrochemical arrays highly for activity oxidationof at+055VinO1MNaOH electrocatalyticglucose solutionTheNi nanowire electrode arraysnonenzymatichadmore than advantages enzymatic biosensorsucha

12、slongtermstabilityA of1043 mM一1 low highsensitivitypA cm，a detectionlimitofO1 on pM basedSN 3 and rapid responsetime 10s The NiNWA proposed electrodeallowed fast highlysensitive，stable，and amperometric of fromtheoxidationofcommon sensingglucoseInaddition，interference interfering asascorbicacidanduri

13、c species，such acid，were effectivelyavoided in3 chapter A novel electrochemicalBisensor tyrosinase basedonhydroxyapatite hasbeen nanoparticleschitosan forthe nanocomposite detectionof developed Ill 硕士学位论文 size-controlledanduniform phenoliccompoundsThe hydroxyapatite nanoparticles werecharacterized e

14、lectron was byScanning immobilizedontothe hydroxyapatitenanopagicles?chitosan matrix-modifedAu andelectrochemical electrodeCyclicvoltammetry impedance wereusedtocharacterizethe electrochemical spectroscopy tyrosinase biosensorsThe electrochemicalbiosensorwasusedtodetermine preparedtyrosinase phenoli

15、c the methodat一02VMoreoverthe compoundsby amperometric effectsof and onthe electrochemicalbiosensor temperature，appliedpotential pH tyrosinase hadbeenstudiedA of x 211 l mM一1cm一2anda performance highsensitivity 03肛A thelimit ofdetectiondownto5x1 rapidresponsetime 8s ，with Michaelis-Mentenconstantsof

16、the electrochemicalbiosensorwere Tyrosinase estimatedtobe 6and131 for 352，31 pM m-cresol，catecholand phenolrespectively biosensorexhibited Furthermore，the long-term and stability，excellentreproducibility the of biosensorwasevaluated recoverytyrosinase with satisfactoryresults in 4 chapter Words：Elec

17、trochemical Nanowire Key sensor；Carbonnanotube；Ni array； Hydroxyapatite；Tyrosinase 纳米材料及生物活r丰酶确：生物传感器中的应用 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书I 摘要II AbstractIII 第1章绪论l 11生物传感器概述1 111生物传感器的分类2 112生物传感器的工作原理2 12电化学酶生物传感器2 121电化学酶传感器的分类3 122电化学酶传感器的原理4 123电化学酶传感器的构建方法4 124电化学酶传感器的发展阶段与趋势5 13纳米材料6 131纳米材料的分类。6 132一

18、维纳米材料6 14本论文构思及主要研究内容9 第2章碳纳米管钯颗粒复合体系用于构建过氧化氢生物传感器11 21前言11 22实验部分12 221试剂和仪器12 222碳纳米管处理12 223金种子的制备12 224电极的修饰12 23结果与讨论13 231 232碳纳米管钯纳米颗粒复合体系修饰电极的电化学特性13 233实验条件的优化15 234修饰电极对过氧化氢的电化学特性16 24小结。18 V 硕上学位论文 第3章基于镍纳米线阵列构建的超灵敏葡萄糖生物传感器的研究19 31前言19 32实验部分20 321试剂和仪器一20 322镍纳米线阵列电极的制备20 33结果与讨论20 331镍纳

19、米线阵列的形貌特征20 332镍纳米线阵列修饰电极的电化学性质22 333葡萄糖生物传感器的电化学性质一24 334干扰研究26 335重现性和稳定性27 34小结27 第4章基于羟基磷灰石纳米材料的新型酪氨酸酶传感器的研究28 41前言29 42实验部分29 421试剂和仪器29 422金电极的修饰29 43结果与讨论30 431酪氨酸酶HAp粒子壳聚糖修饰的金电极的电化学特性30 432实验条件的优化31 433酚类生物传感器的电化学特性33 434生物传感器的重复性、重现性和稳定性36 435与其他基于酪氨酸酶的苯酚类生物传感器性能对比一36 436酪氨酸酶生物传感器的回收率实验37 4

20、4小结38 结论39 参考文献40 附录A攻读学位期间所发表的学术论文目录一52 致谢53 VI 硕上学位论文 第1章 绪论 生物传感器是电化学、医学、热学、光学、生物学及电子技术等多门学科相 互交叉渗透的综合产物，具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉等特 点【，在工农业生产、环保、食品工业、医疗诊断等领域得到了广泛的应用【2，3】。 目前生物传感器已经从化学传感器中分离出来，作为传感器的一个独立分支。成 为一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高科技产物。生物传感器的研 制和开发已取得了显著的进展，在许多行业都具有潜在应用价值，并将使生物传 感器向着微型化、便携化和实用化方向发展

21、f45】。 最近几年，生物传感器的研究工作迅速发展，而纳米技术与纳米材料的介入 为生物传感器的发展提供了无限的发展平台，为生物传感器的创新带来突破【6】， 它们的有机结合使得更为简单、快速、准确、灵敏、低成本的检测分析成为可能。 生物传感器纳米复合材料费用成本低，利用纳米材料固定敏感膜或生物活性酶， 可重复多次使用【_。生物活性酶专一性好，只对特定的底物起反应，因此一般不 需要进行样品的预处理，干扰少，分析速度快，准确率高，相对误差小，操作系 统简单，容易实现自动化分析，而且纳米材料和生物活性酶的有效结合大大增强 了待测物质的信号响应值【8】和稳定性。 II生物传感器概述 111生物传感器的分

22、类 生物传感器研究始于20世纪60年代初，生物传感器主要有两种分类法，即 分子识别元件分类法和转换器件分类法19J。根据分子识别元件的不同可以将生物 传感器分为七大类：免疫传感器、酶传感器、组织传感器、基因传感器、细胞传 感器、微生物传感器【l叫 图11 ；按转换器件分类，生物传感器则可分为：电化学 生物传感器、光化学生物传感器、热生物传感器、声生物传感器、半导体生物传 感器等【111。电化学生物传感器【12】 Electrochemicalbiosensor 是最早问世的生物 传感器，它以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电位、 电流或者电容为特征检测信号，在生物传感器中占

23、有重要的位置。自从20世纪 60年代酶电极问世以来，生物传感器获得了巨大的发展，已成为酶分析法的一个 日益重要的组成部分。特别是最近几年来，电化学生物传感器的研究工作取得了 巨大的进步，其性能和类型也得到了很大的发展17,13】。 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 酶传感器 固定化酶 固定化微生物r三荔磊；固定化惋体抗原! 磊互鬲磊磊磊F?一识别元件卜一免疫传感器 固定化寡 生物组织切片 链核苷酸 固定细胞、f百五赢 基因传感器 图11生物传感器分类 112生物传感器的工作原理 即信号传导器 所构成的分析检测系统【l41，生物传感器由敏感元件和信号传导 器组成【l”。生物敏感元件有：生

24、物体、组织细胞器、细胞膜、微生物细胞、酶、 感受器、核酸、抗体、有机分子等【l61。Turner教授将它简化定义为：生物传感器 是一种精致的分析器件，它将一种生物或生物衍生的敏感元件与理化换能器相结 合，从而产生连续或间断的数字电信号， 信号响应强度与被分析物成比例171。一 个生物传感器便是一个独立的集成器件， 它能够通过与换能器元件保持有直接接 触的生物识别成分，产生特定的分析信息。生物传感器一般由敏感膜 其微观环境 仍可以认为是膜形式，所以膜的含义在这里是广义的 、换能器和信号处理器三部 分组成【l引。生物传感器工作原理是：生物敏感膜内含有能与目标物进行选择性作 用的生物活性组分，通过信

25、息转化器，并将其转化为可检测的物理电信号，经过 信号处理器获得相关信息 图12 。 12电化学酶生物传感器 生物活性酶是一类具有生物催化活性的蛋白质，对特定的底物具有高效的催 化转化能力。酶不仅具有催化反应、加快反应速度的作用，而且还具有高度的专 一性 特异性选择 。正是由于这些特点和性能，使其被非常广泛的应用于各类 化学分析上【1 硕上学位论文 生物敏感元件 电脑 咽一；l 图12电化学生物传感器的原理图 理，他们预示了用一薄层葡萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，可以实现检测葡萄糖 丙烯酰胺凝胶膜固定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器，开创了电化学酶生 物传感器的历史【211。此后，酶传感器越来越

26、引起广大科研工作者的重视，得到了 迅速发展。目前，因为酶传感器具有高度的专一性 特异性选择 ，能够对待测 物质做出快速、准确的响应，而得到临床的广泛应用【221。 121电化学酶传感器的分类 按照经典的分类方式，电化学酶生物传感器可分为电位型酶传感器、电流型 酶传感器和电导型酶传感器三种。电流型酶传感器是利用修饰在电极表面的生物 活性酶对待测底物进行专一性的催化氧化或还原作用，从而记录电极上酶促反应 产生的电流信号，建立输出电流大小与待测物浓度之间的关系，利用能获得电流 信号转换的检测装置获取相应的电信号【23,24J。电位型传感器是指酶电极与参比电 极间输出的电位信号，固定到电极表面的酶对待

27、测底物催化氧化或还原，产生离 子型物质，能引起指示电极电位改变 即酶电极与参比电极间输出的电位信号 ， 电位变化关系遵循Nernst方程【2纠。电导型传感器是利用在酶促反应中，体系反应 前后电荷的改变引起的电导的改变。根据电导的改变值与生物活性酶的关系，即 可测定待测底物的浓度。电流型传感器与电位型传感器相比较具有更简单、直观 的优点12 6。电流型酶传感器是生物传感器领域中研究较多，且灵敏度较高的一类 电化学生物传感器，它基于酶化学反应和异相电子转移反应，在恒定电位的条件 下，电流型酶传感器的反应过程是按照相应的反应机理进行的【2。71。 纳米材料及生物活性酶在生物传感器中的应用 122电化

28、学酶传感器的原理 电化学酶传感器由信号转换器和生物敏感分子两部分组成【2引。固定化生物活 性酶具有高度的专一性 特异性选择 ，可以选择性识别被待测物质，从而发生 酶促反应，产生化学响应信号；信号转换器将化学信号转变为电信号，从而达到 检测的目的。信号转换器即基础电极可采用金属电极 金电极、铂电极等 、碳质 电极 玻碳电极、碳糊电极等 及自制的修饰电极【291。当修饰了敏感酶膜的电极 浸入到含有待测底物的被测溶液中，待测底物进入酶膜内部参与化学反应，大部 分酶反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性 物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定130。优秀的酶传感器具有选择

29、性 好、灵敏、分析速度快等特点，此外重现性和稳定性也尤其重要。在酶固定化技 术上首先要满足保持生物酶的良好生物活性，进而才可以获得较高的灵敏度及保 持酶的高度选择性，以达到良好的抗干扰能力【311。 123电化学酶传感器的构建方法 科研工作者针对生物传感器的界面固定方法展开了大量的研究，如何简单， 有效的固定生物活性酶在电极表面，形成稳定的、高活性的生物活性敏感膜，对 电化学酶传感器的发展至关重要。目前，常用的活性酶的固定化方法主要有以下 硕1：学位论文 其他化学试剂，也不需要采取活化、清洗等步骤，因而能最大限度地保持酶的生 物活性。吸附法主要包括静电吸附法【46】和物理吸附法【47】等。即将

30、含有酶的溶液修 饰在电极表面，溶剂自然挥发、室温干燥。该方法简单，操作条件温和，但由于 生物分子与固体界面结合能力弱，易渗漏，从而导致稳定性差14引。 124电化学酶传感器的发展阶段与趋势 电流型酶传感器的构建主要经历了三个发展阶段，第一代酶生物传感器149J 是以酶的天然介体氧作为媒介体的，第二代酶生物传感器是基于二茂铁等人工合 成的媒介体，第三代酶生物传感器 L50,51】利用酶与电极间的直接电子转移。 第一代生物传感器是利用天然存在的氧作为媒介体，从而实现生物活性酶与 电极之间的电子传递。响应信号与氧的分压或溶氧关系很大，利用的是生成的过 氧化氢在电极上的电氧化的输出信号来检测底物浓度，过氧化氢的测试电位比较 高，过高的电位，使得电极的选择性很差，很