受体配体简ppt课件

1、1,第八节受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors, RBA）,岳 凌,2,一、总 论,受体（receptor，R） 细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。,3,配体（ligand，L） 能与受体特异性结合的生物活性分子。 配体 内源性配体 外源性配体,4,RBA 原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结合反应。 应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定受体-配体复合物的

2、放射性，经过数据处理，可求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。,5,RBA的分类 定量RBA 可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常以平衡解离常数表示）。 定性RBA 发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研 究受体-配体的相互作用等。,6,RBA的应用 神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗,7,二、概 述,1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype),8,2. 受体与配体结合的基本特点 1）可饱和性

3、(saturability) 2）特异性(specificity) 3）适度的亲和力（affinity） 4）可逆性(reversibility) 5）识别能力(recognition)和生物效应的一致性,9,受体与配体特异性结合的特点： 亲和力高，结合容量小。 亲和力：受体与配体的结合能力。 平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD） 指占据半数受体所需的配体浓度。 KD值愈小，表明亲和力愈高；KD值愈大，亲和力愈低。,10,三、单位点系统RBA的基本规律,（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律 1. 质量作用定律 k1,v1 R +

4、L RL k2,v2 根据质量作用定律： v1 = k1 R L v2 = k2 RL,11,当反应达到平衡后， v1 = v2 即： k1 RL = k2 RL 则平衡解离常数（KD）的数学表达式（1.1）为： KD k2 RL k1 RL,12,2. 饱和曲线(saturation curve),1）饱和曲线 当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此RL的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，RL的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线 。,13,2）设LT为配体的初始浓度，RT为受体

5、的 初始浓度，则有： L = LT RL R = RT RL 将上式代入(1.1)式，经整理得： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0,14,饱和曲线的形状和KD有关（如图1）。,图1 KD对饱和曲线的影响,15,饱和曲线曲线的高度取决于RT（如图2）。,图2 RT对饱和曲线影响,16,3. Scatchard作图,由式（1.1）整理可得： KD RT-RLL RL 将上式整理可得： RL = RT 1_ RL L KD KD,17,以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值RL/L为纵坐标作图，即为Scatchard作图。 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线

6、，斜率为 -（1/KD），横轴截距为RT，纵轴截距为RT/ KD（见图3）。,18,图3 简单单位点系统RBA的Scatchard作图,19,（二）非特异性结合(non-specific binding，NSB),NSB 在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。 NSB的特点 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图4）。,20,图4 饱和曲线实验中TB、SB和NSB的关系,21,在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性(total binding，TB)，必须减去

7、NSB，才能得到特异性结合(specific binding，SB)的数据。,22,四、RBA的基本方法,离体RBA的基本方法可概述如下： 1. 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞组分的分离制备等） 2. 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等） 3. 温育 4. 分离结合和游离的放射性标记配体 5. 测定结合部分的放射性 6. 数据处理,23,标记配体的基本要求 1）高比活度 2）亲和力高 3）特异性强 4）放射化学纯度高,24,五、定量RBA的数据处理,定量RBA主要是通过已知标记配体的量和比活度，以及测得的样本的数据，应用数学模型求出受体的有关参数如受体密度RT、

8、KD等。,25,1. 单点法实验的数据处理,通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量（maximum binding capacity，Rmax）。 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 fmol/106细胞。,26,单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式如下：,RT = _RL的cpm_ 探测效率（）配体比活度标本的蛋白量（DNA量）或细胞数,27,2. 简单单位点RBA的多点法实验,多点法实验可分为简单单位点和双位点(多位点)两方面，它们

9、又可各自分为饱和曲线实验和竞争结合实验两类。,28,简单单位点饱和曲线的数据处理,1. Scatchard模型 以复合物浓度RL为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值RL/L为纵坐标作图，实际应用时，RL/L的浓度比值由放射性的比值B/F代表。,29,具体公式如下： ： RL = B = RT 1_ RL L F KD KD 以B/F对RL作图应为一条直线，斜率为-(1/KD)，直线与横轴的交点为RT值，与纵轴交点为RT/KD。,30,2. 计算机曲线拟合 饱和曲线的直接表达式为： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0 其中，LT是自变量（横坐标），RL是因变量（纵坐标），RT和KD是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归法进行曲线拟合，可以得到RT和KD的值。,31,应 用,1. 放射受体显像： 放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。,32,33,34,35,2. 受体介导的靶向治疗