第11章免疫分析

1、第十一章 免疫分析技术和相关仪器,第一节 酶免疫分析仪,一、酶免疫分析技术的分类：,酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为: 酶扩大免疫测定 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法 非均相酶免疫测定 固相酶免疫法,(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）,需要了解的基本概念,酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA) 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离

2、的方法主要通过固相载体，故此法称为固相酶免疫测定ELISA 。 ELISA的测定模式 : 双抗体夹心法 间接法 竞争法,双抗体夹心法（三明治法）原理,固相支持物表面,包被抗体,标记抗体,待测物,夹心法的剂量-反应关系曲线,信号强度（Y）,线性范围,待测物浓度（X）,Hook效应,竞争法的原理,固相支持物表面,待测物,包被抗体,标记抗原,竞争法的剂量-反应关系曲线,待测物浓度（ X ）,信号强度（ Y ）,线性范围,间接法原理,包被体,待测抗体,包被抗原,标记抗体 （二抗）,俘获法原理,俘获抗体 （二抗）,待测抗体,标记抗原,包被体,双抗原夹心法原理,包被体,待测抗体,包被抗原,标记抗原,我们把

3、采用酶标的方法测定物质含量的设备称为酶标仪。 一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能，还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐。 全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。,二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构,微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等,有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于： 比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度,1、微

4、孔板固相酶免疫测定仪器,2、半自动微孔板式ELISA分析仪,在酶标仪的基础上再配置: 加液器 温育器 洗板机 测读仪 测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。,3、全自动微孔板式ELISA分析仪,自动化酶免疫分析系统由: 加样系统 温育系统 洗板系统 判读系统 机械臂系统 液路动力系统 软件控制系统等组成,温育箱,反应板,迭式存储器,X-Y头架,样品架 50根装 503,4根独立上下吸移管,检 测 光 纤,反应板 反应板 夹具,清 洗 装 置,供水箱 废水箱,检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例,仪器操作各单元如下（满板） 加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器） 加酶时

5、间： 4分46秒(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5分30秒 加终止液： 2分42秒 读板时间： 2分58秒,优势,自动化程度高： 前后处理一体化设计，减少人与样品的 接触机会，降低感染。各种自动安全检 测能。 稳 定： 只要避免人为操作错误， 可连续数年良好工作。 准 确： 不存在交叉感染。反应振荡， 确保检测 准确。,高 速： 加注、读板速度快 扩 展 性： 软件可升级，样本量增加，可联机使用 用户做主更多： 开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档,4、管式固相酶免疫测定仪,1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系

6、统和配套试剂 用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物ABTS 测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点定标 测定的精密度CV在3%左右,5、微粒固相酶免疫测定仪,美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径0.47m）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。 第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。 以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。,6、磁微粒固相酶免疫测定仪,瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和试剂组成： 试剂包括

7、： 抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体 特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1m） FITC结合的特异抗体或抗原 碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原 底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯 反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。,什么样的反应,磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫复合物，洗涤，加酶底物显色。,三、酶免疫分析仪的性能评价和维

8、护保养,（一）评价指标和方法 1滤光片波长精度检查及其峰值测定 2灵敏度和准确度 3通道差与孔间差检测 4零点飘移 5精密度评价 6线性测定 7双波长评价,重点是光学部分 1滤光片波长精度检查 2通道差与孔间差检测,四、酶免疫分析仪的临床应用,病原体及其抗体的检测 2各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3肿瘤标志物 4多种激素 5药物和毒品,辣根过氧化物酶的色原底物,HRP最常用的色原底物有: 邻苯二胺(OPD)、2，2-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6)ABTS(杂环吖嗪) 四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对,OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下

9、，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2-二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。,TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。 测定波长：450nm,氧化耦联色原底物对 HRP的氧