药物分析（湖南大学） 第04章 药物定量分析与分析方法验证.ppt

1、第四章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法 第二节 定量分析方法的特点 第三节 药品分析方法的验证 第四节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析样品的前处理方法,在进行药物定量分析之前，一般需根据分析方法的特点，化学原料药的结构与性质及药物制剂的处方组成采用不同的方法对试样进行前处理，以满足所选用的分析方法对试样的要求。 含金属或卤素、氮、硫、磷等元素的药物的分析方法通常可分为： （1）不经有机破坏的分析方法 （2）经有机破坏的分析方法,一、不经有机破坏的分析方法 不对药物分子中的有机结构进行完全破坏; 仅选用适当的溶剂溶解样品使待测元素离子电离或经简单回流处

2、理使有机结合的待测元素原子离解而转化为无机盐类后测定。 适用于含金属有机药物或结合不牢固的含卤素等药物的分析。 根据操作方法不同，主要有：直接测定法、经水解后测定法、经还原分解后测定法。,直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属的有机药物或某些C-M（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可电离，不需经有机破坏，直接进行测定。 配位滴定法：利用二价金属离子可与乙二胺四乙酸二钠形成配位化合物，直接乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定。 氧化还原滴定法：利用不同价态的金属离子的氧化还原性，选用适当的滴定液直接或间接滴定法测定含量。,例1：葡萄糖酸钙的含量测定 取本品，加水溶

3、解后，在氢氧化钠碱性条件下，以钙紫红素为指示剂，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色。,例2：葡萄糖酸锑钠的含量测定 本品所含的五价锑具有氧化性，在酸性溶液中可氧化碘化钾并析出碘，选用间接碘量法，用硫代硫酸钠滴定液滴定。,经水解后测定法 碱水解后测定法：将含卤素的有机药物溶解于适当的溶剂中，加NaOH溶液回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机形式的卤素离子，然后选用间接银量法。本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素和脂肪碳相连者。 酸水解后测定法：将含金属的有机药物与适当的矿酸（如盐酸）共热，将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐，然后选用配位滴定或剩余酸

4、碱滴定法测定。,例2：三氯叔丁醇的含量测定 取本品，溶于乙醇后，加NaOH溶液并加热回流，使有机结合的氯水解生成NaCl，与AgNO3生成AgCl沉淀，过量的AgNO3用NH4SCN溶液滴定(指示剂:Fe3+)。,例1：十一烯酸锌的含量测定 本品与稀盐酸共沸，水解生成十一烯酸和氯化锌，用乙二胺四乙酸钠滴定液直接滴定锌离子。,经还原分解后测定法。 含碘有机药物，当碘原子直接与芳环连接时，碘的结合比较牢固，采用碱性溶液回流是难以使C-I键断裂，但可在碱性人溶液中加入还原剂（如锌粉）回流，使其转化为无机碘化物后测定。,例：泛影酸的含量测定 取本品约0.4g（精密称定），加NaOH试液30ml与锌粉1

5、.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤三次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用AgNO3（0.1mol/L）滴定液滴定。,+ 11NaOH + 3Zn ,NaI + AgNo3 AgI+ NaNO3,碘他拉酸、胆影酸、碘番酸等均采用同法测定,胆影酸,碘他拉酸,碘番酸,二、经有机破坏的分析方法 含金属及含卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中的待测原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原的方法难以将有机结合的待测原子转变为无机形式； 须采用有机破坏的方法将药物分子中有机结构部分完全破坏，使有机结合形式的待测原子转变为可测的无机离子

6、（或氧化物、无氧酸等）后方可分析。有机破坏方法包括：湿法破坏、干法破坏。,湿法破坏 适用于含氮有机合成药物分析的前处理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理； 亦可用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除。 主要分解剂：硫酸 辅助分解剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢。 湿法破坏可分为：硫酸-硝酸法、硫酸-高氯酸法、硫酸-硫酸盐法、硝酸-高锰酸钾法。,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理 将含氮有机药物与硫酸和硫酸盐在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氨，并于过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵

7、； 经NaOH碱化后释放出氨气，并随水蒸汽馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。 加入硫酸盐的作用是：提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法原理（续） 催化剂（如汞或汞盐、硒粉、铜盐、二氧化锰）：加快氧化分解的速度，以缩短反应时间。 硫酸铜因价廉易得，且无挥发、毒性低，常被用作本法的催化剂。 对某些难以分解的药物（如含氮杂环结构药物），在氧化分解过程中常需加入辅助氧化剂，使分解完全并缩短分解时间。常用的辅助氧化剂有30%过氧化氢和高氯酸。高氯酸为强氧化剂，用量不宜过大。,以硫酸-硫酸盐法

8、为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法操作（常量法）,氧化分解,吸收与滴定,以硫酸-硫酸盐法为基础的含氮有机药物定量分析方法凯氏定氮法应用范围 中国药典主要应用本法测定含氨基或酰胺结构的药物含量； 对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，需在消解前加入锌粉还原后再依法处理； 杂环中的氮，因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解； 对于含氮量较高（10%）的样品，可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨。,干法破坏 本法主要适用于含卤素、硫、磷等有机药物分析的前处理，亦可用于某些药物中硒及砷盐的检查。根据破

9、坏方式可分为高温炽灼法和氧瓶燃烧法。 高温炽灼法： 原理： 将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而到测元素转化为无机元素或可溶性无机盐，以供分析。,应用范围：本法主要适用于含卤素药物的鉴别，亦可用于含磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查。根据分析对象与目的不同，常加无水Na2CO3、Mg（NO3)2、Ca(OH)2、ZnO等辅助灰化。 含碘药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中。直火炽灼，或与无水Na2CO3混匀后，炽灼至紫色的碘蒸汽产生。 含氟、氯、溴等元素药物的鉴别：将适量样品置于坩锅中，与无水Na2CO3（或Na2CO3-K2CO3混合物）混合，炽灼至完全灰化，加水溶解后鉴别。,

10、含磷药物（如甘油磷酸钠注射液）的定量测定：精密称取样品1ml，置于瓷坩锅中，加氧化锌1g，加热碳化后在600炽灼1h，放冷，加水与盐酸个5ml，加热煮沸使溶解后，用钼蓝比色法测定。 砷盐的检查：有机结合的砷经与无水Na2CO3或Ca(OH)2、Mg(NO3)2共热（700）转化为无机砷酸盐后，依法检查。本法主要用于高分子化合物（如：右旋糖酐铁）或植物提取物（如：大豆油）中砷盐的检查，亦应用与少数有机药物（如吡罗昔康、布美他尼等）.,氧瓶燃烧法： 原理：将含待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，而待测元素根据电负性的不同转化为不同的氧化物（

11、或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在）以供分析。本法适用于含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴别、限度检查或含量测定，亦可用于药物中杂质硒的检查。,仪器装置：燃烧瓶为500ml、1000ml或2000ml的磨口、硬质锥形瓶，瓶塞应严密，底部熔封铂丝一根（直径：1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的2/3。通常取样量为1020mg，使用500ml燃烧瓶；加大样品取样量（200mg）时可选用1000ml或2000ml的燃烧瓶,AF氧瓶燃烧装置与样品包装操作图,操作法：,燃烧瓶内加入规定的吸收液瓶口用水湿润,小心急速通入氧气后盖上表面皿,点燃包有供试品的滤纸，迅速放

12、入燃烧瓶中,按紧瓶塞，用少量水封闭瓶口,俟燃烧完毕后充分振摇，使生成的烟雾完全吸收,用少量水冲洗瓶塞和铂丝，合并洗液和吸收液,用同法另作空白实验,依法进行鉴别、检查或含量测定,例：碘苯酯的含量测定 本品主要为10-对碘苯基十一酸乙酯与邻、间位的碘苯基十一酸乙酯的混合物。,碘苯酯,测定方法,O2/燃烧,I2(HIO3、HIO、HI),3NaIO,NaIO3 + 2NaI,3Br2 + I- + 3H2O,IO3- + 6HBr,Br2 （过量的）+ HCOOH,2HBr + CO2,IO3- + 5I- + 6H+,3I2+ 3H2O,OH-,I2 + 2Na2S2O3,2NaI + Na2S4

13、O6,氧瓶燃烧法中的装置和材料有（） A. 磨口硬质玻璃锥形瓶 B. 磨口软质玻璃锥形瓶 C. 铂丝 D. 铁丝 E. 无灰滤纸 F. 铝丝,自测题,氧瓶燃烧法可用于 A. 含卤素有机药物的含量测定 B. 醚类药物的含量测定 C. 检查甾体激素类药物中的氟 D. 检查甾体激素类药物中的硒 E. 芳酸类药物的含量测定,氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为（） A. H2O2溶液 B. H2O2-NaOH溶液 C. NaOH溶液 D硫酸肼饱和液 E. NaOH-硫酸肼饱和液,容量分析法的特点 在容量分析法中，常需借助指示剂的颜色改变来判断滴定终点的到达。但滴定终点与反应的化学计量点不一定

14、恰好符合，二者之差称为滴定误差，是容量分析误差的来源之一，为了减少滴定误差，需要选择合适的指示剂。 容量分析法所用仪器价廉易得，操作简便、快捷，方法耐用性高，测定结果准确（通常相对误差0.2%）。但专属性（选择性）较差，一般适用于含量较高的试样分析（如化学原料药）,容量分析法的有关计算 滴定度：每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，中国药典规定滴定度用mg表示。 滴定度的计算： 设被测药物分子（A）与滴定剂（B）之间的反应如下：,反应完全时，被测药物的量（WA）与滴定剂的量（WB）的关系为：,MA：被测药物分子量 MB：滴定剂分子量,被测药物的量（WA）可有下式计算：,nB：被测药物

15、消耗的滴定剂的摩尔数 mB：滴定液的摩尔浓度 VB：被测药物消耗的滴定剂的体积,单位体积（VB=1mol）的滴定液相当于被测药物的量被称为滴定度，用T表示，量纲为mg/ml。,例：维生素的含量测定 用碘量法测定维生素CM(C6H8O6)=176.13的含量时，碘滴定液的摩尔浓度为0.05mol/L（以I2为单元），化学反应式如下： 求碘滴定液的滴定度T。,含量的计算： 用容量分析法测定药物的含量时，滴定方式有直接滴定法和间接滴定法。 直接滴定法：用滴定液直接滴定被测药物，被测药物的百分含量计算式如下：,若配置的滴定液的摩尔浓度与中国药典中规定的浓度不一致时，应将滴定度乘以校正因素F。,间接滴定

16、法：包括生成物滴定法和剩余量滴定法 生成物滴定法：被测药物与化合物A作用，定量生成化合物B，再用滴定液滴定化合物B。该法的百分含量计算方法与直接滴定法相同。 例：葡萄糖酸锑钠的含量测定,Na2S2O3滴定液的滴定度T,剩余量滴定法：先加入定量的过量的滴定液A，使其与被测药物反应，再用另一滴定液B来回滴定反应剩余的滴定液A。本法常需进行空白实验校正。 其百分含量可按下式计算：,W：供试品的称取量 TA：滴定液A的滴定度 FB：滴定液B的浓度校正因子 VB0：空白实验时消耗的滴定液B的体积 VBS：样品测定时消耗的滴定液B的体积,溴滴定液的滴定度T,二、光谱分析法 光谱分析法，是利用物质的光谱进行

17、定性、定量和结构分析。通过测定被测物质在光谱的特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对物质进行定性或定量分析的方法称为分光光度法。 中国药典收载的光谱分析法有：紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分析法等。,紫外-可见分光光度法 紫外光区：200400；可见光区：400760nm 朗伯-比尔定律 A：吸光度；T：透光率；L：比色皿厚度； C：每100ml溶液中所含被测物质的重量（g）； E：吸收系数，以 表示，物理意义为当溶液 浓度为1%(g/ml)，L为1cm时的吸光度。,特点 灵敏度高（10-410-7g/ml） 准确度高（相对误差：2%5%） 仪器价格低廉，操作简单，易于普

18、及。 应用广泛，借助化学计量学方法，可不经分离直接测定混合物中各组分含量。,仪器校正和鉴定 波长校正:利用汞灯或氘灯中的较强谱线。 吸光度的准确度的检定：利用重铬酸钾的硫酸溶液在规定波长处的吸收系数。 杂散光的检查：利用规定浓度的碘化钠或亚硝酸钠溶液在规定波长处的透光率。,对溶剂的要求 含杂原子的有机溶剂具有很强的末端吸收，使用时不能超出其截止波长（如甲醇和乙醇的截止波长为205nm）。 溶剂的吸光度： 220240nm，0.40 241250nm，0.20 251300nm，0.10 300nm以上，0.05,测定方法 对照品比较法:,CX：供试品溶液的浓度；AX：供试品溶液的吸光度 CR：

19、对照品溶液的浓度；AR：对照品溶液的吸光度,吸收系数法:,CX：供试品溶液的浓度（g/ml）； AX：供试品溶液的吸光度； ：被测成分的百分吸收系数(要求：100）； 100：浓度换算因素，将g/100ml换算成g/ml。,显色法:当供试品在紫外-可见光区没有强吸收，或虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂显色后进行测定。,荧光分析法 利用荧光强度与溶液中发射荧光的物质的浓度成正比关系进行定量分析。 特点 灵敏度高（10-1010-12g/ml） 适用与低浓度溶液（浓度太高可致“自熄灭”） 对易被光分解的样品，需使用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。 能产生荧光的物质较少

20、，常需使用荧光衍生试剂得到强荧光，以提高灵敏度和选择性。,干扰因素的排除 溶剂：溶剂不纯会带来较大误差，蒸馏后再使用。 溶液：悬浮物对光有散射作用，过滤或离心除去；溶解氧有降低荧光的作用，通入惰性气体除氧。 玻璃仪器：玻璃仪器和测定池应高度洁净。 温度：温度对荧光强度有较大影响，需控制温度。,测定法,CX：供试品溶液的浓度 Cr：对照品溶液的浓度 RX：供试品溶液的荧光强度 Rr：对照品溶液的荧光强度 RXb：供试品溶液试剂空白的荧光强度 Rrb：对照品溶液试剂空白的荧光强度,色谱分析法 利用混合物中各组分在吸附剂上的吸附能力的不同或在两相中的分配系数的不同，先行分离后再在线对各组分逐一进行分

21、析。 高效液相色谱法： 灵敏度高（10-1210-15g/ml） 高选择性 高效能 高速度 应用广泛,对仪器的一般要求 色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶、辛基（或氨基、氰基）硅烷键和硅胶、离子交换剂（离子交换色谱）、凝胶或高分子多孔微球（分子排阻色谱）；,柱温：室温 进样量：数微升 检测器：紫外检测器,重复性： 连续进样5次，峰面积测量值的相对标准偏差不大于2%。 拖尾因子（T）：,W0.05h：5%峰高处的峰宽 d1：峰顶点至峰前沿5%峰高处之间的距离,应用峰高法定量时，T值应在0.951.05之间。,外标法：,AX：供试品的峰面积；AR：外标物质的峰面积 CX：供试品的浓度；CR：外标物

22、质的浓度,由于微量进样器不易精确控制进样，当采用外标法定量时，宜用自动进样器进样。,气相色谱法 对仪器的一般要求 色谱柱：填充柱（材质：不锈钢或玻璃，载体：硅藻土或高分子多孔小球）或毛细管组柱（材质：玻璃或石英，固定液：甲基聚硅氧烷等）. 检测器：氢火焰离子化检测器 进样量：数微升 检测温度：250350C（以免水汽凝结）,气相色谱系统适应性实验同高效液相色谱。 测定法： 除高效液相色谱项下规定的两种方法外，亦可采用标准溶液加入法。,AX：供试品中待测组分的峰面积 Ais：加入对照品后待测组分的峰面积 CX：供试品中待测组分的浓度 CX：加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度,测定法方法的选择

23、手工进样：采用内标法 自动进样：采用内标法或外标法 顶空进样：标准溶液加入法 当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法的结果为准。,含量测定方法 原料药的含量测定：用已知纯度的对照品或供试品进行测定，计算回收率。,制剂的含量测定：用含已知量被测物的制剂各组分混合物进行测定，回收率按上式计算。如不能获得制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，回收率则应按下式计算。,杂质定量测定方法 杂质定量测定多采用色谱法，其准确度可通过向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测试。 如不能获得杂质或降解产物，可将本法测试结果与另一成熟的方法进行比较。 应表明单个杂质或杂质总量相当于主

24、成分的重量比（%）或面积比（%）。,数据要求 至少用9个测定结果进行评价； 应报告已知加入量的回收率(%)，或测定结果的平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信度。,二、精密度 在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。 精密度可用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。,标准（偏）差（SD）,偏差（d）：测量值与平均值之差,相对标准（偏）差（RSD),验证内容 重复性： 在较短时间间隔内，在相同的操作条件下由同一分析人员所测的结果的精密度（批内精密度）。 至少用9个结果进行评价。 中间精密度：在同一实验室，在不同时间，由不同人员用不同设备所测定结果的精密度。 重现性

25、：在不同实验室，由不同人员用不同设备所测定结果的精密度。,数据要求 应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。,三、专属性 在其他成分可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。 鉴别反应专属性：应能与可能共存的物质或结构相似的化合物区分，不含被测成分的样品均应呈负反应。,含量测定和杂质测定专属性 色谱法和其他分离法，应附代表性图谱，且标明诸成分的位置。 对于含量测定，试样中应加入杂质，考察测定结果是否受干扰。 对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质能否得到分离。 在杂质或降解产物不能获得时，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，并与另一个经过验证的方法比较。,四、检测限 (li

26、mit of detection, LOD) 试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。它反应方法的灵敏度，无需准确定量。 常用方法 目视法： 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。 适用于非仪器分析法（如显色鉴别法、薄层色谱法检测杂质）。,信噪比法： 用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠检测出的最低浓度或量。 一般以信噪比S/N =3（或2)时的相应浓度或量确定为检测限。,数据要求 使用56份试样，其浓度为近似或等于检测限目标值，进行分析，以可靠地测定检测限。报告应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限 (limitation o

27、f quantitation, LOQ) 试样中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。 杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。 LOQ的测定方法与LOD的方法相同，只是相应的系数不同。LOQ为S/N=10时的相应浓度或量。,六、线性 测试结果（响应值）与试样中被测物的浓度或量直接呈正比关系的程度。 制备至少5份供试品溶液进行测定，以测得的响应值（或其数学变换值）作为被测物浓度的函数做图，观察是否呈线性，再用最小二乘进行线性回归。 数据要求：应列出回归方程、相关系数以及线性图。,七、范围 指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间

28、。 涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证。 原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%120%。 制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%130%。,溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的20%。 如规定了限度范围，则应为下限的-20%至上限的+20%。,八、耐用性 指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。,典型的变动因素：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 液相色谱法中典型的变动因素：流动相的组成和pH值，不同厂牌或批号的同类型色谱柱、柱温和流速等。 气相色谱法中典型的变动因素：不同厂牌或批号的同类型色谱柱、固定相、不

29、同类型的载体、柱温、进样口和检测温度等。,HPLC法 RSD0.999，截距应趋于零; 专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除.,各种含量测定方法对效能指标的要求（续）,精密度是指（） 测得的测量值与真值接近的程度 测得的一组测量值彼此符合的程度 表示该法测量的正确性 在各种正常试验条件下，对同一样品分析所得结果的准确程度 对供试物准确而专属的测定能力,自测题,药物杂质检查所要求的效能指标为（） A. 准确度 B. 精密度 C选择性 D. 检测限 E. 耐用性,精密度的一般表示方法有( ) A. 相对标准差 B. 相对平均偏差 C. 相对误差 D.

30、绝对误差 E. 标准差,检测限的表示方法有（） A. 百分数 B. ppm C. ppb D. g E. ng,用信噪比法表示检测限时，信噪比一般应为（） A. 11 B. 31 C. 41 D. 51,用碘量法测定维生素C原料药时，要求碘量法应具备（） A. 选择性 B. 定量限 C. 精密度 D. 检测限 E. 线性,测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求( ) A. 精密度 B. 定量限 C. 耐用性 D. 回收率 E. 检测限,药物鉴别试验所要求的效能指标（） A. 准确度 B. 精密度 C. 选择性 D. 检测限 E. 耐用性,供测定用血样的采集：动物实验时，可从动脉或

31、心脏取血；对与患者或志愿者，采取静脉血（或用毛细管采血）。 血浆的制备：将采取全血置于含有抗凝剂（如肝素、草酸盐、EDTA等）的试管中，混匀后，以25003000r/min离心5min使血浆与血细胞分离，上清液为血浆。 血清的制备：将采取全血在室温下放置0.51小时，待血液凝固后，用细玻棒剥离血饼，以20003000r/min离心510min，上清液为血清。,药物与纤维蛋白几乎不结合，血浆与血清中的药物浓度测定值通常是相同的。但血浆比血清分离快，且制取的量多，所以血浆较血清更常用。 血样采取后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定，应置于具塞硬质玻璃管或聚乙烯塑料离心管中密塞保

32、存。 短期保存时，可置于冰箱冷藏（4C）；长期保存需在-20C或-80C下冷冻贮藏。,唾液 由腮腺、额下腺、舌下腺和口腔粘膜内腺体分泌液混合组成的。口腔粘膜受化学刺激，各唾液腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变化。 唾液的采集：在安静状态下进行，漱口后15分钟收集；采集后立即除去泡沫，并以3000r/min离心10分钟，取上清液分析。 若分泌量少，可转动舌尖促进唾液分泌，也可采用物理的（如嚼石蜡）或化学的（如酒石酸）方法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。 唾液采集后，应在4C以下保存。,尿液 其主要成分：水、含氮化合物（大部分为尿素）及盐类。 体内药物（原型或代谢物及其缀合物）的

33、清除主要通过尿液排出。 尿液中药物浓度高，采集方便、且采集量大。但尿液浓度变化较大。尿液中药物浓度的改变不能直接反应血药中的浓度。 尿液测定主要用于药物剂量回收，尿清除率、生物利用度、以及药物代谢及其代谢途径、类型、速率等的研究。,采集的尿液是自然排尿。 测定尿中药物的总量时，应收集用药后的一定时间内（如8h、12h或24h）排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，在乘以尿量求得排泄总量。 肾功能不良者不宜采集尿样。 尿液采集后应立即测定，否则应加入防腐剂后置于冰箱中保存。 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、三氯甲烷，以及醋酸、盐酸等。,二、生物样品分析前处理技术 生物样品的前处理应

34、主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和所采用的测定方法。 依据生物样品类型： 血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出。 唾液样品应采用离心去除粘蛋白。 尿液样品常采用酸或酶水解药物使从缀和物中释出。,依据被测药物的结构及性质，以及存在形式： 药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。 是否具有挥发性涉及能否采用气相色谱法测定。 光谱特性及官能团性质涉及是否需要制成衍生物。 浓度大的样品对前处理要求低，浓度越低的样品对前处理要求越高，,依据所采用的测定方法： 纯化程度与所采用的测定方法的专属性、检测系统对不纯样品污染的程度密切相关。 放射免疫测定法具有较高的灵敏度和专属性，生物样品只需经初

35、步处理除去主要干扰物即可测定。 高效液相色谱法要求除去生物样品中的蛋白质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。,蛋白质的去除 原因： 除去蛋白质可使蛋白质结合型的药物释放出来。 避免溶剂萃取过程中的乳化现象。 保护仪器性能（如保护HPLC柱不被玷污），延长使用寿命。,方法： 加入与水混融的有机溶剂 有机溶剂使蛋白质凝聚，释放与之结合的药物。 常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。 含药物的血浆与有机溶剂的体积为1:(13)时，可除去90%以上的蛋白质。,加入中性盐 中性盐使溶液离子强度发生变化，将与蛋白质结合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。 常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸

36、橼酸盐 加入强酸 当溶液的pH低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根离子形成不溶性盐而沉淀析出。,含药物血清与强酸比例为1:0.6混合，可除去90%以上蛋白质。 常用强酸：10%三氯醋酸、65%高氯酸、5%偏磷酸。 过量的三氯醋酸经加热分解为三氯甲烷和二氧化碳而除去。 过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和后，加乙醇使之生成高氯酸钾（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。,加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐而沉淀。 含药物血清与沉淀剂比例为1:2混合。 常用沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-

37、NaOH。,酶解法 测定某些与蛋白质结合牢固、且对酸不稳定的药物时，需用酶解法使蛋白质分解而释放出药物。 常用酶：枯草菌溶素（适用pH：7.011.0，温度：5060C ）。,缀合物的水解 原因： 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物可与内源性物质葡萄糖醛酸或硫酸形成葡萄糖酸酐或硫酸酯缀合物。 缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂萃取。 尿中药物多数呈缀合物状态，测定之前，需将缀合物中的药物释放出来。,方法： 酸水解：加入适量的盐酸溶液进行水解。 酶水解 遇酸及受热不稳定的药物，可用酶水解； 酶水解具有较高的选择性、很少使被测药物发生降解，常被优先采用； 常用葡萄酸酐酶或硫酸酯酶或二者混合

38、物； 但酶水解时间长、酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及污染色谱柱。,有机破坏 生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难以用溶剂萃取，同时金属离子可耐受高温。 测定生物样品中金属离子时，多采用有机破坏方法进行前处理。 常用HNO3-HClO4作为消解剂，其破坏能力强，适用与各种生物样品。所得金属离子一般为高价态。 仪器常用硅玻璃和磞玻璃制成的凯氏烧瓶。,分离、纯化与浓集 生物样品中的药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需进行分离、纯化与浓集处理。 液-液萃取法 多数药物是亲酯性的，而血样或尿样中的多数内源性干扰物是强极性的水溶性物质。有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。 有机溶剂的

39、要求：对被测药物的溶解度大、沸点低、易于挥发浓集、与水不相混溶、无毒、不易乳化。,常用有机溶剂：乙醚和三氯甲烷 有机溶剂相与水相的容积比为1:1或2:1。 多数药物是亲酯性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多数是酸性的，生物样品中的药物一般在碱性下萃取。 对碱性pH不稳定的药物，可在近中性pH处用三氯甲烷和异丙醇萃取。 中性药物则在pH=7附近萃取。,液-固萃取法 将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或内源性干扰物保留在担体上，用适当的溶剂洗去干扰物后，再用适当的溶剂将药物洗脱下来。 优点：较少引入杂质、消除了乳化现象、萃

40、取效率高、处理样品速度快，在室温下操作、适于处理挥发性及对热不稳定的药物。 担体：亲水性的硅藻土、疏水性的活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。,浓集 末次少量溶剂萃取法 在末次萃取时加入的萃取液尽量少，使被测组分萃取到小体积溶剂中，然后直接吸取适量供测定。 挥发萃取溶剂法。 避免直接加热，防止被测组分破坏或挥发损失。,挥发萃取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干。 对与易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可用减压法挥发溶剂。 溶剂蒸发所用试管，底部应为尖锥形，便于最终量取。,化学衍生化 药物中含有活泼H者（如 -COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH）均可被化学衍生化。生物样品经化学衍生化在进行分离的目的： 使样品中的药物转变成具可被分离的性质 提高检测的灵敏度 增强药物的稳定性 提高对光学异构体分离的能力,GC中化学衍生化 衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而降低GC温度。 主要衍生化反应：烷基化、酰化、硅烷化。 常用烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等。,常用酰化试剂：已酸酐、丙酸酐等。 常用硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）。,HPLC中化学衍生化 衍生化目的