《聚合酶链反应PCR》PPT课件.ppt

1、第三节 聚合酶链式反应Polymerase chain reactionPCR,Content of Table,定义 技术优点 原理 标准反应体系 反应五要素 热循环条件的选择 反应特点 常见问题与对策 污染 10 应用,1 定义,在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。,Home,2 技术优点,特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等,Home,3 原理,Region to be copied,denaturatation,Primer annealing,Primer extension,Cycle 2,Cycle 3,PCR技术原理,类似于DN

2、A的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA变性：加热至94左右，双链DNA解离成单链； 模板DNA与引物的退火(复性)：55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链； 重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。,PCR product,PCR反应曲线,Home,4 标准反应体系,10扩增缓冲液 10l 4种dNTP混合物 各200mol/L 引物 10100 pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5

3、 u （Mg2+） 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,Home,5 反应五要素,引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,5.1 引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度,引物设计的原则,引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右 引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布,避免引物内或引物间出现

4、二级结构 避免两引物间互补，特别是 3端 引物 3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 引物中可以加上合适的酶切位点 要作酶切时加 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 两引物的Tm值接近,5.2 酶及其浓度,Taq DNA聚合酶 注：无3 5方向的校正活性 DNA复制1/109；PCR 出错率1/(2104) 一个典型的 PCR 反应约需酶量 2.5 U 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,5.3 dNTP 的质量与浓度,dNTP使用注意： 1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解； 2)使用量：在P

5、CR反应中，dNTP应为20-200umol/L。 3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等；,5.4 模板（template）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。,5.5 Mg2+浓度,1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响: Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶活性，使反应产物减少。 2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜；,Home,6 热循环条件的选择,PCR反应条件: 温度 时间 循环次数,6.1 温度与时间的设置, 设置变性-退火-延伸三个温度点： 标准反应

6、中采用三温度点法： 1）93-95变性； 2）40-60退火； 3）70-75延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 一般采用94变性，65左右退火与延伸, 变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394 l min足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度,复性温度,当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1M NaCl） Tm = 4

7、（G+C）2（A+T） 复性温度=Tm值 -（510）,复性时间,一般3060 sec，足以使引物与模板间完全结合, 延伸温度与时间：,温度： 一般7075，常用温度为72。 时间： 根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。,6.2 循环次数,决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 选在2540次之间,Home,7 反应特点,7.1 特异性强,靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。,7.2 灵敏度高,PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为3个细菌,7.3

8、简便、快速,在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般13 小时完成。,7.4 对模板的纯度要求低,可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA或RNA扩增检测。,Home,8 常见问题与对策,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高，延伸时间太短,现象：正对照有条带，而样品则无,原因,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象： 1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致； 2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,1) 引物特异性差, 2) 模板或引物浓度过高 3) 酶量过

9、多 4) Mg2+浓度偏高 5) 退火温度偏低 6) 循环次数过多,原因,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,1) 模板不纯或降解 2) Buffer不合适 3) 退火温度偏低 4) 酶量过多 5) dNTP、Mg2+浓度偏高 6) 循环次数过多,原因,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,1) 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2) 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 3) 各种试剂先进行分装，低

10、温贮存。,对策,假阳性,Home,9 PCR污染,9.1 污染原因,(1) 模板间交叉污染 (2) PCR试剂污染 (3) 实验室中克隆质粒的污染,9.2 防止污染的方法,(1) 合理分隔实验室 (2) 移液枪不能接触PCR相关试剂 (3) 手套、吸头、小离心管一次性使用 (4) 设阳性和阴性对照，重复实验,Home,10 PCR技术的应用,(1) 基因组中特异片段克隆 (2) 不对称PCR (3) 反向PCR (4) 基因的体外诱变 (5) RT-PCR (6) 基因组的比较研究,Home,基因组中特异片段的扩增,5,3,3,5,5,3,5,3,3,5,3,5,5,3,5,3,5,3,3,5

11、,5,3,5,3,引物序列特征,引物设计, ,5,3,3,5,5,3,3,5,3,5,3,5,5,5,5,3,3,5,5,5,基因组中特异片段的扩增,3,3,3,3,模板变性，引物退火,引物延伸,循环变性、退火、延伸,5,3,3,5,5,3,3,5,3,3,5,3,5,3,5,5,5,5,5,5,3,3,不对称PCR,双引物退火,双引物扩增,单引物扩增,产生大量的单链DNA片段,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,反向PCR正确流程,环化,引物设计,5,3,3,5,5,第一个循环模板变性、引物退火和延伸,多次循环：模板变性、引物退火和延伸，得大量PCR产物,5,3,3,5,5,3,

12、3,5,5,3,3,5,反向PCR错误流程一,环化,引物设计,PCR扩增,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,反向PCR错误流程二,引物设计,PCR扩增,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,反向PCR错误流程三,引物设计,PCR扩增,A,T,A,T,A,T,G,C,5,3,3,5,5,3,5,3,3,5,3,5,5,3,3,5,基因的体外突变,管1,管2,引物设计,管1引物设计,管2引物设计,A,T,G,C,5,3,3,5,5,3,3,5,A,T,G,C,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,5,3,C,G,G,C,基因的体外突变,管1,管2,管1 PCR扩增,管1产物,管2产物,管3 = 管1+管2 退火,管2 PCR扩增,5,3,5,3,5,5,C,C,5,3,3,5,G,基因的体外突变,管3,管3,管3,管3,管3,5,3,5,3,G,G,5,3,3,5,5,C,5,G,5,3,3,5,5,C,5,G,C,设计的双引物退火,引物延伸,切口连接,产物的PCR大量扩增,A,T,5,3,3,5,C,5,3,3,5,G,原始基因,定点突变基因,AA,5,3,AA,5,3,TT,5,AA,5,3,TT,5,3,mRNA,mRNA,mRNA,c