猪胃蛋白酶原A基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究样本

1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。猪胃蛋白酶原A 基因密码子优化及在毕赤酵母中表示的研究摘 要天冬氨酸蛋白酶一般被称为酸性蛋白酶 , 在酸性条件下可催化水解蛋白质 , 是当前重要的工业用酶之一。 胃蛋白酶属于天冬氨酸家族 , 是研究蛋白质结构与功能关系的重要模型。胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中。胃蛋白酶经济价值高 , 用途广泛 , 胃蛋白酶在制革、 方便食品、 奶、 口香糖加工制造等行业也有一定的用处。当前 , 商业、 医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取 , 受动物脏器资源的限制 , 胃蛋白酶价格较高 ; 容易残留一些动物自身的蛋白酶类 , 如一些组织蛋

2、白酶等。而微生物反应器具有效率高效 , 操作简单 , 能够降低成本等优点 , 因此 , 经过筛选微生物反应器 , 然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途 . 本文利用基因工程开展胃蛋白酶的表示研究, 为解决这些问题提供了新的研究方向。第一 ,根据 Genebank 上公布的猪胃蛋白酶原A 基因序列 ,进行引物设计 ,经过RT-PCR克隆获得了湖北白猪胃蛋白酶原A 基因。第二 ,在猪胃蛋白酶原A 克隆和序列分析的基础上,构建了毕赤酵母胞内表示载体 pPIC3.5K-pA 。研究不同 pH 、 不同诱导时间、 不同启始浓度和甲醇诱导浓度等因素对表示量的影响。第三 , 根据毕赤酵母密码子的偏嗜性 , 利

3、用定点突变 , 对稀有密码子进行了优化 ,希望能够进一步提高重组酵母表示量。关键词 :胃蛋白酶原 A;毕赤酵母 ;克隆 ;表示 ;优化资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。AbstractAsparticacidproteases,known asacidicproteases,cancatalyze thehydrolysis of protein under the acid condition. Pepsin is wildly presented ingastric juice of vertebrate .Currently, commercially use

4、d pepsin is generallyobtainedfrom animalstomach tissue,which isveryexpensiveand un-purebecauseof the animal organs resource constraints and other proteases . Therefore, agreat interesthas been focusedon the new method of producingpepA (PepsinogenA). Among these, the microbial production is supposed

5、to be the most promisingmethod because of its high yield, simple production process and lower cost.Therefore,theobjectiveofthisstudyistryingtoproduceefficientlyrecombinant porcine pepsin with genetic engineering technology in microbialsystem. Asparticacidproteasesare widelyappliedin the fieldsoffeed

6、 additive,vintage, food, leather and medicine. Porcine pepsin A, which is the importantmodel for the study of structure-function relationship of protein, belongs tothe familyofasparticprotease.Using gene engineeringtostudythe expressionof pepsin will supply a new way for solving these questions in t

7、his paper.Firstly, the primers were designed according to the sequence J04601 inGenebank. And then the swine pepsinogenA cDNA, which was clonedby RT-PCRfromthe Hubei White swine.Secondly,the recombinantplasmidofpPIC3.5K-pA was constructed.Effectsof different pH, different inductive time, different i

8、nductive concentrationand methanol inductive concentration on the expression yield were studied.Thirdly,based on the codon biasofPichiapastorisand used SMDtechnology,optimizationofthe rarecodons, which could influencethe yieldofrecombinant,was directed successfully. The further research is expected

9、to raise the yield资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。of recombinant yeast.KEY WORDS: Pepsinogen A, Pichia pastoris , Cloning, Expression, Optimization第一章酸性蛋白酶的研究进展蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶 , 在生产、 生活及科学研究领域的应用中占有重要地位。根据活性部位上功能基团种类的不同 , 蛋白水解酶可分为四大类 : 丝氨酸蛋白酶、 天冬氨酸蛋白酶、 半胱氨酸蛋白酶、 金属蛋白酶 1 。天冬氨酸蛋白酶是以两个天冬氨酸残基为活性中心的肽链内切酶 ,

10、 其代表性特征是能够在酸性环境条件下水解动植物蛋白质 ,将两个疏水氨基酸打断 ,故一般将天冬氨酸蛋白酶称为酸性蛋白酶。1.1酸性蛋白酶的种类经过内切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸2 。酶;酸性蛋白酶被分为三个蛋白家族 3 , 分别是 A2 起溶酶体的蛋白降解作用 , 包括组织蛋白酶A 1 起消化作用 ,包括胃蛋白酶和凝乳D 和 E; A3 起荷尔蒙调节作用 ,主要是高血压蛋白原酶。其中A 1 和A 2 蛋白家族具有较高的相似性, A3、A 1 和A 2家族的相似性则相对较低。微生物酸性蛋白酶则被分为两种1 :(i) 由曲霉、 青霉、 根霉、 链孢霉等产生的类胃蛋白酶 ;(ii) 由毛霉和内座壳

11、属产生的类凝乳酶。1.2酸性蛋白酶的来源蛋白酶是有机体生存所必须的,在自然界中普遍存在 ,来源也呈多样性。传统工资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。艺中胃蛋白酶和凝乳酶主要是从猪、 牛、 羊等动物的胃粘膜中获得 ; 素食食品加工业中应用的酸性蛋白酶主要是从木瓜、 菠萝、 无花果属植物中提取 ; 现有的饲料用酸性蛋白酶主要来源于微生物产生。 能够产生酸性蛋白酶的微生物有 : 黑曲霉、 米曲霉、 宇佐美曲霉、 根霉、 微小毛霉、 泡盛曲霉以及它们的变异株、 突变株。另外 , 在逆转录病毒、 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 等也有分泌酸性蛋白酶的报道 4-6 。1.3酸性蛋白

12、酶的性质酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物 , 不同来源的酸性蛋白酶 , 虽具有一些共同性质 , 但在底物特异性、 抑制剂、 激活剂等方面均存在着一定的差异。1.3.1最适作用 pH 和 pH 稳定性酸性蛋白酶在 pH 值 1.0 5.0之间均比较稳定 ,一般随着 pH 的升高酸性蛋白酶的活力会逐渐的降低,当 pH 大于 6时,酶活力基本丧失。不同来源的酸性蛋白酶的最适作用 pH 稍有不同。1.3.2最适作用温度和温度稳定性酸性蛋白酶一般在50 以下较为稳定 ,可是随酶的来源不同而有所差异。如猪的胃蛋白酶最适温度为40 ,在 50 水浴中保持 20 min,其剩余酶活力为30 , 65

13、水浴中保持10min其酶活力基本丧失7 。1.3.3抑制剂一般情况 ,酸性蛋白酶的抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌酸性蛋白酶一般不受胃蛋白酶抑制剂对- 苯的抑制 ,但却对 N- 溴代琉珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。另外 ,并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂抑制,如黑曲霉产的蛋白酶A 1, A2 和Scytalidium ligrcolum产的蛋白酶B 对其均不敏感。1.3.4金属离子对酸性蛋白酶的影响有多数实验证明8,9, Cu2+、Mn2+等离子在低浓度(小于5 mmol/L)下 ,对酸性蛋白酶具有显著的激活作用; Ag+对酸性蛋白酶具有显著但相对较弱的抑制

14、作用;金属离子浓度对蛋白活性的影响较大,一般浓度大于 10 mmol/L时, Cu 2+、 Mn2+也会表现出不同的抑制作用 ;另外 ,酸性蛋白酶的作用底物不同,金属离子对活性的影响也有差异,但抑制或激活的趋势却不变。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。1.4酸性蛋白酶基因工程研究进展一般在工业中应用的酸性蛋白酶对其本身的性质都有特殊的要求。而蛋白质工程使重新设计基因 , 合成具有特殊功能重组酶成为可能。 重组 DNA 技术和定点突变 ( SDM) 技术又推动了蛋白质工程的快速发展。 利用基因工程技术改进酸性蛋白酶性质以实现其在工业上的应用 ,是酸性蛋白酶的新的研究方

15、向1 。1.4.1国内外酸性蛋白酶基因工程研究当前 ,国内在医药与食品领域中应用的酸性蛋白酶,主要是胃蛋白酶和凝乳酶,是从猪、 牛、 羊等动物粘膜中提取 ,产量较低 ,价格昂贵 ,难以满足市场需要。在饲料添加剂领域中应用的酸性蛋白酶主要来源于微生物生产,国内微生物酸性蛋白酶的研究主要经过辐射、紫外线和亚硝基胍等物理和化学方法诱变选育产酶活力高、抗逆性好的菌种,获得了一些很有应用前途的产酶菌株7,8。酸性蛋白酶的基因工程方面的研究近年才开展 ,邱重晏等 9,10 成功克隆出微小毛酶凝乳酶结构基因并在毕赤酵母中得到表示进行了粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆。而胃蛋白酶的基因工程研究还未开展。在国外

16、,酸性蛋白酶基因工程方面的研究开展较早,相关的报道较多 ,还重组凝乳酶产品已经获得上市,并取得了显著的经济效益。1.4.1.1胃蛋白酶在天冬氨酸家族中胃蛋白酶的特异性和动力学,催化和抑制机制以及胃蛋白酶原的激活机制的研究最为深入,而且猪胃蛋白酶原和胃蛋白酶是蛋白质相关结构和功能关系的重要模型。胃蛋白酶是由一条单链组成的单体酶, 属天冬氨酸蛋白酶家族 , 是一种内切酶 ,有 326(7) 个氨基酸残基 , 含有 2个构象相似的结构域 , 2 个活性位点Asp32: 、Asp215:( 一个是以一 COOH形式存在 ,-个半肤氨另一个是以一 COO 一的形式存在 ), 6资料内容仅供您学习参考，如

17、有不当或者侵权，请联系改正或者删除。基酸残基 , 3 对二硫键 , 5 个色氨酸残基 , 16 个酪氨酸残基 , 14 个苯丙氨酸残基。分子量约为 34.SKD。胃蛋白酶在 pH 范围 1-3 时活性较高 , 最适 pH 在 2 左右 , 当 pH大于 6时,胃蛋白酶便失去了活性,而且是不可逆失活11 。胃蛋白酶的前体被称为胃蛋白酶原。猪胃蛋白酶原是多肽链,包括15个氨基酸信号肽, 44个氨基酸活性肽, 327个氨基酸胃蛋白酶成熟肽,从mRNA得到的cDNA 约有1.2 kb。A、B 、C、D四种类型胃蛋白酶原中氨基酸组成有较大变化, Pro-5, Leu-6, Arg-8在A-C型中相同,A

18、sp-32, Asp-215 是活性中心的两个天冬氨酸残基 , 它们的初级和高级结构与其它天冬氨酸家族成员有很高的同源性 12 。1.5酸性蛋白酶的应用酸性蛋白酶发现于二十世纪初,包括有胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶等而微生物因为其广泛的生化多样性和基因容易改造而成为理想的蛋白酶资源。 酸性蛋白酶现已广泛应用于饲料、 食品、 酿造、 毛皮与皮革、 医药、 胶原纤维等各个行业之中。近年来 , 酸性蛋白酶在作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂上的应用得到人们广泛的重视5,13,14,15。1.6本研究的目的和意义饲料资源不足一直是中国养殖业面临的一个大问题 , 在耕地和水资源严重紧缺

19、的情况下 , 粮食产量的提高已很困难。中国动物生产中饲料转化率低 , 猪、 鸡、 奶牛等饲料转化率均比国际先进水平低 0.3 0.6 个百分点 , 使得饲料资源不足的问题更加严峻。解决饲料资源不足的问题 , 能够从开源和节流两方面着手。开源即开发各种饲料资源 , 特别是非常规饲料资源 , 节流即提高现有饲料资源利用率。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足。 添加外源性的消化酶能够补充内源消化酶的不足,提高饲料的利用率;消除饲料中的抗营养因子,降低动物消化道食糜的黏度,改进消化机能;改进肠道菌群分布,提高动物健康状况;参与动物内分泌调节,提高畜禽体内激素代谢水平;减轻畜牧生产对环境的污染;促进细胞包围的淀粉、 蛋白质、 脂肪的释放 ,经过水解细胞壁 ,使营养物质被充分吸收。 因此 ,饲料用酶制剂在养殖业有着广阔的应用前景。1.6.1本研究的目的资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。胃蛋白酶在饲料、皮革、 酿酒、医学等领域具有很高的经济价值。但到当前为止 , 市场上的胃蛋白酶主要来源于动物的胃组织 , 如牛、 羊、 猪等的胃组织。动物源胃蛋白酶存在很多的问题 , 受动物脏器资源的限制 , 胃蛋白酶产量