细胞生物学课件：第二章 研究方法

1、第二章 细胞生物学的研究方法,第一节 显微镜技术,光学显微镜 : 观察显微结构 （light microscope) 显微镜 电子显微镜 : 观察亚显微结构 (electron microscope),一、光学显微镜,(一)普通光学显微镜 ：以日光或灯光为光源 分辨力：能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。常用极限分辨率来表示： 0.61 分辨率(R) = NA （NA为镜口率，为波长） NA = n sin ( n为介质的折射率， 为视锥半顶角),（二）荧光显微 原理： 荧光物质在短波光（紫外线、蓝光）的激发下光能转换发出长波光线（可见光） 2. 结构：增加短波光线激发装置（汞灯、氩灯） 3

2、. 应用：自发荧光物质、荧光染色、荧标记的观测 激光共聚焦显微镜：利用针孔激光作为光源，降低临近部位光的干扰，提高荧光图像的清晰度，并只摄取一个光切面的图像。 利用电脑对多个光切面图像进行三维重构，可获得立体图像。,（三）相差显微镜 1原理：利用光的衍射和干涉，将被检物体不同密度部位产生的相位差放大， 转换成振幅差。 光的颜色波长 光的亮度振幅 2应用：活体细胞的观察,相差显微镜观察体外培养的贴壁细胞,二、电子显微镜 1. 原理：以电子束代替光线，电磁场代替透镜 2. 特点： (1) 分辨力强，可达0.1nm (2) 物体的亲电子差异反映物体的颜色和密 度差异 电镜下观察到的结构称为亚微结构或

3、超微结构,3. 结构： 电子枪、电子加速器、 磁场透镜、载物台、 显示屏等 4. 分类： 透射电镜、 扫描电镜、 隧道扫描电镜,二、细胞化学法技术,一、细胞化学：用特异的方法使待测化学成分 着色或显示 （一） 细胞特殊染色 1. 核酸： 普通染料：Feulgen染色，甲基绿派洛宁染色 荧光染色：丫啶橙、溴化乙啶 2. 蛋白质：特殊染料（双偶氮反应、粘洋红、 粘苏木素） 3. 糖：高碘酸雪夫氏试剂反应,（二）酶细胞化学技术：特殊的生色底物 金属盐沉淀：胶体金颗粒 色素形成 （辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶） 嗜锇着色法（电镜） （三）免疫细胞化学：抗原、抗体反应 免疫组织化学（辣根过氧化物酶、碱性磷

4、酸酶） 免疫荧光,三、原位杂交（In Situ Hybridization，ISH） 用不同颜色的荧光标记的DNA探针（probe），在细胞核或染色体上杂交显色，鉴别特异基因序列,广泛应用于基因诊断和定位,染色体端粒检测 基因定位及诊断,二、放射自显影 同位素标记 使乳胶（胶片）感光 显影成像 三、化学发光 辣根过氧化物酶标记 鲁米诺（lumino）发光 乳胶（胶片）感光成像,四、细胞的分离和分析技术,一、离心分离技术：利用离心力和物质沉降系数的差异进行分离 沉降系数 S 表示沉降速率 （一）利用颗粒大小来分离：p M 1. 差速离心法：利用细胞内不同组分的沉降系数差异，由高到低逐级分离 2.

5、 移动区带法：利用不同浓度的介质溶液所形成的密度梯度来分离沉降速率不同的物质。 不连续密度梯度：蔗糖、Ficoll、甘油 （二）利用颗粒大小来分离：p =M 等密度（连续）梯度：氯化铯（CsCl）,差速离心的原理,移动区带离心,等密度离心 分离溶酶体、线粒体和微体,等密度离心 分离DNA、RNA和蛋白质,第二节 细胞培养与细胞融合,（一）细胞培养 概念：活体组织分离或建系的细胞在体外一 定条件下培养，使之继续生长繁殖的 技术方法。 2. 条件：培养基、温度、PH值、湿度、渗透 压、O2 3. 分类：原代培养、传代培养,原代培养(primary culture),直接从机体取下细胞、组织和器官后

6、立即进行培养,传代培养（secondary culture）,将适应体外生长的原代培养细胞转移并扩大培养 细胞系（cell line）:同一组织来源细胞在传代培养成功后形成的转化（永生）细胞。 细胞株（cell strain）:由单个转化细胞增殖克隆化后形成的具有稳定形态和生化标记的细胞。 一般哺乳动物细胞在体外传代次数为30-50代 转化细胞和恶性肿瘤细胞可以无限繁殖,贴壁生长 体外培养的细胞贴附在瓶壁上生长， 称为细胞贴壁，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。 单层培养的细胞保持接触抑制(contact inhibition)的特性。 悬浮生长 细胞在培养过程中不贴壁， 一直悬浮在培养液

7、中生长。如淋巴细胞。,分类： A、异核体：不同来源的细胞核融合 B、同核体：相同来源的细胞核融合 C、合核体：异源染色体合并在一起（杂种细 胞）,第三节 分子生物技术,一、分子分离与鉴定技术 凝胶层析分离：凝胶过滤、离子交换、亲和层析 凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳,二、 核酸分子杂交技术 利用DNA变性、复性原理，用一条已知序列DNA链（探针，probe）与目的DNA互补杂交，检测目的基因是否存在的技术,核酸杂交的原理,southern bloting 操作步骤,southern bloting 结果,基因芯片技术 （DNA microarrays or DNA c

8、hips),概念：基因芯片技术是DNA杂交探针与半导体工业技术相结合的产物。 将许多探针做成芯片，固定于支持物上，然后与待测DNA样品进行杂交。应用于大规模筛查基因突变或表达。,Gene screening using a DNA microarray.,分子杂交的种类,Southern杂交 用单链核酸探针检测目的DNA序列的技术（英国科学家Southern发明） Northern杂交 用单链核酸探针检测RNA的技术（与DNA检测相对应，人为命名） Western杂交 用标记抗体检测蛋白质的技术（与核酸检测技术相似，人为命名）,三、PCR技术原理 （1）变性，在95高温下模板双链DNA解开成单链DNA。 （2）退火，将反应系统降至55，使引物能与模板单链DNA的特定部位配对结合。 （3）链延伸：在72，以单链为模板，在引物的3末端以互补原则合成新链。,四、基因重组技术 体外对DNA进行重组、克隆，涉及到的工具酶有： 限制性内切酶：识别特定的碱基序列，并能在DNA链中间切断磷酸二酯键的酶。已发现有200多种 酶切后，粘性末端与平头末端 两种类型,粘性末端与平头末端,EcoR I,GAATTC,CTTAAG,5,3,5,3,5,G,CTTAA,AATTC,G,3,3,5,粘