免疫SOP：Tn-T作业指导书

1、77文件编号：LABOPMY020第 页，共 页 版本：A/0生效日期：2008-02-01XXXXXX 医院检验科免疫室分析项目作业指导书 Elecsys E 170/E 411乙肌钙蛋白T(TroponinT)1. 分析原理采用双抗夹心法原理，整个过程18分钟完成。 第1步：15l标本、生物素化的抗肌钙蛋白T单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗肌钙蛋白T单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。 第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。 第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过

2、光电倍增管进行测定。Elecsys自动将标本产生的光电信号与从肌钙蛋白T定标液得出的Cutoff值相比较。2. 标本要求血清：使用标准取样试管或含分离胶的试管采集。血浆：EDTA-K3 或柠檬酸钠抗凝。（不要使用肝素抗凝血浆或草酸盐/氟化物抗凝血浆。确保标本不被肝素污染。）标本在28 度可稳定24 小时，-20 度可稳定12 个月。只可冻融一次。含沉淀的标本使用前需离心。标本和质控品禁用叠氮钠防腐。标本、定标液和质控品在测定前的温度应与室温平衡；放入仪器后应在2 小时内测定以避免蒸发的影响。3. 试剂、校准品、质控品和其他所需材料采用罗氏原装配套试剂。试剂：M： 链霉亲和素包被的微粒（透明瓶盖

3、），1瓶，12ml。粒子浓度0.72mg/ml，含防腐剂。R1：生物素化的抗肌钙蛋白T单克隆抗体（灰盖），1瓶，18ml，浓度1.5mg/l，磷酸缓冲液100mmol/l，pH6.0含防腐剂。R2：Ru(bpy)32+标记的抗肌钙蛋白T单克隆抗体（黑盖），1瓶，17ml。浓度1.2mg/l，磷酸缓冲液100mmol/l，pH 8.0含防腐剂。校准品：Cal 1 阴性定标液（白盖），2*1ml血清, 含防腐剂Cal 2 阳性定标液（黑盖），2*1ml血清，含防腐剂质控品：Elecsys 肌钙蛋白T质控品1和2 （PreciControl Troponin T）货号03530469其他所需材料：E

4、lecsys2010/cobas e 411分析仪需要Elecsys 系统缓冲液（ProCell）货号11662988Elecsys 测量池清洗液（CleanCell）货号11662970Elecsys 添加剂液（SysWash）货号11930346Elecsys 系统清洗液支架（Adapter for SysClean)）货号11933159Elecsys 2010 反应杯（Assay Cup)货号11706802Elecsys 2010 吸样头（Assay Tip)货号11706799E170/cobas e 601分析仪需要Elecsys 系统缓冲液（ProCell M）货号048803

5、40Elecsys 测量池清洗液（CleanCell M）货号04880293Elecsys 系统缓冲液/测量池清洗液预热杯（PC/CC-Cup）货号03023141探针冲洗液，12x70ml,用于最终保养及完成试剂吸样后冲洗，货号03005712Elecsys 反应杯/吸样头盒(AssayCups/AssayTips Combimagazine M)货号12102137Elecsys 废物盒(wasteliner)货号03023150Elecsys 系统清洗液支架(SysClean Adapter M)货号03027651各种分析仪均适用的材料Elecsys系统清洗液（SysClean）货号

6、112985004. 仪器和校准使用仪器：瑞士罗氏诊断公司生产Elecsys 2010/E 170/E 411全自动电化学发光免疫自动分析仪仪器校准：每批肌钙蛋白T试剂盒必须用新鲜试剂和肌钙蛋白T Cal 1,Cal 2定标一次。另外，以下情况需要再次定标：Elecsys2010： 一个月（同一批号试剂） 7天（放置仪器上的同一试剂盒）各种分析仪均适用的情况：根据要求进行标定：如质控结果超出范围时；根据规定进行多次标定。5. 操作步骤（以E 170为例）5.1 校准操作步骤：在编缉各项目的参数时，已经在ApplicationCalib菜单中定义好了定标类型和几点定标。因此在对各项目进行定标时，

7、只需在定标菜单Calibration中进行即可。3.2进入CalibrationStatus菜单，用鼠标选择需定标的项目，再根据需要点单点定标（BLANK键）或两点定标（TWO POINT键）、跨距定标（SPAN键）、多点定标（FULL键），再选择其它项目进行相应选择，最后点SAVE，将定标物放入在CalibrationCalibrator中定义好的位置，点Start，再点Start，仪器开始定标。 在CalibrationStatus菜单中看定标结果，点Calibration Result键看定标结果，点Reaction Monitor键看每个定标物的反应曲线。5.2 样本检测程序： 单个样

8、本输入，在主菜单下选择Workplace- Testslection，在Sequence No栏输入标本号，然后选择该标本所需做的单个项目或组合项目，点SAVE键，样本号自动累加。批量常规标本的输入，在主菜单下选择Workplace- Testslection，在Sequence No栏输入起始标本号，然后选择该标本所需做的单个项目或组合项目，点REPEAT，输入该批标本的最后一个标本号，点OK即可。进样分析，将标本按在Workplace菜单中输入的标本号顺序在样本架上排好，放入进样盘内,按START键，输入该批上机标本的起始标本号，再点START键，仪器自动开始推架检测标本。6. 质量控制用

9、Elecsys 肌钙蛋白T质控品1和2 （PreciControl Troponin T）。质控品1和质控品2至少每24小时或每一次定标后测定一次。质控间隔期应适用于各实验室的具体要求。检测值应落在确定的范围内，如出现质控值落在范围以外，应采取校正措施。7. 计算方法仪器会自动根据Cal 1和Cal 2的测定值计算Cut-off值。每一个标本的结果以有反应性或无反应性以及Cutoff指数形式（标本信号/ Cutoff）报告。8. 参考范围通过对1951位健康人群测定其肌钙蛋白T，其99百分位数参考值上限 0.01ng/ml数据来源：1999年4月，多中心评估第三代肌钙蛋白T1999年3月，全球

10、Elecsys 1010 心肌标志物研究根据新的定义，当血中肌钙蛋白水平超过健康人群99百分位数的值时定为心肌梗死。建议肌钙蛋白浓度测定达到CV为10时的浓度定为医学诊断指标，对于Elecsys肌钙蛋白T，此值为0.03ng/ml。基于1997年WHO定义的心肌梗死定义，根据ROC分析，肌钙蛋白T的临床阈值为0.1ng/ml如有必要，各实验室应自己测定一个参考值。9. 分析性能准确性：以下列出了此试剂盒在Elecsys仪器上的表现。每个实验室结果会不同。重复性测定采用的是美国临床化学实验室标准委员会修订稿EP5-A标准方法进行评估，使用了Elecsys试剂及人血清池、质控进行测定：连续测定10

11、天，每天测定6次（n60次）；E170的批内重复性共测定了21次。结果如下：分析灵敏度（最低检测限）：0.01ng/ml分析灵敏度代表了能与零区别的最低的TNT值见下图。肌钙蛋白T浓度在0.03ng/ml时，测试的重复变异系数为10诊断灵敏度及特异性：数据标本来源于294例胸痛患者及10周内被怀疑心肌梗死并进入急诊室的患者。154（171份标本）位患者由于AMI或者其他严重的疾病（如肺栓塞）未入院，被排除在外。58（576份标本）位根据WHO定义的急性心肌梗死患者， 50位（396份标本）不稳定心绞痛患者，32位（212份标本）无急性缺血性综合征患者入院。这些标本均在入院后0，3，6，12，2

12、4，48，72及96小时采血进行以下测定：Elecsys 肌钙蛋白T第二代酶法肌钙蛋白TElecsys CK-MB质量法Stratus CK-MB质量法总CK活力法入院后分析其临床灵敏度及检测心埂的特异性，并得到与其他方法的比较情况见下表。入院后三小时，绝大多数的AMI患者得到有效的再灌注治疗。10. 干扰因素该方法不受黄疸（胆红素27mg/dl）、溶血（血红蛋白1.1g/dl）、脂血（脂质1500mg/dl）和生物素5mg/天）治疗的病人，至少要等最后一次摄入生物素8 小时后才能采血。不受类风湿因子干扰（2000U/ml）。50 种常用药物经试验对本测定无干扰作用。TnT 浓度高到400ng

13、/ml 也不出现钩状效应。接受过小鼠单抗治疗或体内诊断的病人会出现假阳性反应。肌钙蛋白T 测定结果应结合病人的病史、临床症状和其他检查结果进行诊断。11. 临床意义肌钙蛋白T（TnT）是横纹肌收缩的功能蛋白。尽管所有横纹肌中的TnT功能相同，但心肌中TnT（心肌TnT，分子量39.7kD）与骨骼肌TnT明显不同。心肌TnT（cTnT）具有高的组织特异性，是心脏特有的，是心肌细胞损伤的一个高敏感性标识物。在急性心肌梗塞（AMI）情况下，心脏症状出现后3-4小时血清肌钙蛋白T水平升高，并持续升高达14天1,2。肌钙蛋白T是一个预测急性冠状动脉综合征（ACS）患者近期、中期和远期预后的独立指标3,4

14、,5,6,7。另外，4个多中心试验（超过7000名患者）显示肌钙蛋白T也能用于判定患者抗血栓治疗（GPIIb/IIIa 抑制剂，低分子量肝素）是否有效8,9,10,11,12。现已证实心肌钙蛋白是ACS患者一个独立的预后指标，并能指导抗血栓治疗，因此欧洲心脏病学会（ESC）和美国心脏病学会（ACC）联合委员会重新定义了心肌梗塞（MI）。根据最新定义，临床上的急性心肌缺血患者，当血液中心肌钙蛋白浓度超过第99百分位数的参考限值（健康人群）即可诊断为 MI。肌钙蛋白检测第99%百分位数判定限值的变异系数必须定义为小于或等于1013。因此，ACS患者合并心肌钙蛋白和/或CK-MB升高被认为是非ST段

15、升高MI（NSTEMI）；而如果心肌钙蛋白和CK-MB仍在参考范围内，诊断为不稳定性心绞痛。目前，MI的重新定义也是新ACC/AHA指导的一部分14，ACC/AHA用于管理不稳定性心绞痛和NSTEMI患者。在心肌梗塞重新定义的基础上，结合ACS患者心肌蛋白检测的作用，现已公布了几条相关建议15,16。血液中由于心肌细胞损伤引起的肌钙蛋白T升高也能发生在其他临床疾病如充血性心脏衰竭17，心肌病18，心肌炎19，心脏挫伤20，肾脏衰竭21，肺栓塞22，中风23，脓毒性休克时左心功能障碍24，和介入治疗如心脏手术25、非心脏手术26、PTCA27，以及药物引起的心脏毒性28。多数情况下特别是肾衰患者心肌钙蛋白水平升高预示患者预后不佳29,30,31,32,33,34。总之，肌钙蛋白水平升高提示心肌细胞损伤，但此升高并不等同于缺血损伤机制。当有证据表明心脏损害，并且临床检测出与心肌缺血一致的标志蛋白时，才考虑心肌梗塞MI。若临床检查提示不可能为缺血机制，则需追踪其他原因的心脏损伤15。Elecsys Troponin T分析试剂有两种特异人心肌钙蛋白T单克隆抗体35,36。抗体能识别位于心肌钙蛋白中心的两个抗原识别簇（氨基酸位置125-131和136-147），心肌肌钙蛋白由288个氨基酸组成。Elecsys Troponin T分析试剂可检测游离的肌钙蛋白T和肌钙蛋白二价