细胞与分子免疫学：Western Blot原理与方法

1、Western Blot原理与方法,Diagram,通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。蛋白质的Western Blot技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng中等大小的靶蛋白。,原理,Western Blot原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。 电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。 酶免疫定位 将转印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后

2、，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。,广泛用于蛋白质样品分析研究,一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,（一） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 溶液中的带电颗粒在电场作用下的移动大致受到三方面影响： 颗粒性质：体积大小及形状、实际电荷数、解离强度等。 环境：电解质或缓冲液的浓度、离子强度、pH值、温度等。 应用电场：电场强度。,蛋白变性,Tris-Cl(pH 6.8) SDS 甘油 溴酚蓝-巯基乙醇,高温变性,形成SDS-蛋 白质复合物,加入 Sample buffer,沸水浴5min,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,SDS （十二烷基磺酸钠）是一种阴离子表面活性剂。加入蛋白质样品中，

3、它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合， 强还原剂（巯基乙醇）可以断开蛋白质分子内的二硫键破坏蛋白质分子四级结构，使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电的SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，其所带负电荷的量远远超过它原有的净电荷，从而消除了不同分子之间原有净电荷的差异。因此，经SDS处理的蛋白电泳时，与电荷和形状无关，只与蛋白质样品的分子量有关。,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,产物：三维网状结构

4、凝胶,Tris-Cl,四甲基乙二胺（TEMED）,丙烯酰胺（Acr）,过硫酸胺（AP）,亚甲双丙烯酰胺（Bis）,丙烯酰胺（Acr）单体，在催化剂过硫酸胺（AP）和加速剂TEMED的存在下，丙烯酰胺产生聚合反应，形成长链，加入交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis），形成三维网状结构的凝胶。 凝胶的网孔大小取决于聚合链的长度及交叉连接的程度。聚合链的长度决定于聚合反应中的单体丙烯酰胺浓度。而凝胶中网孔的大小则由Acr与Bis的相对比例决定，调节单体与交连剂的浓度比例，可形成不同网孔大小的凝胶，适用于不同大小物质的分离。 聚丙烯酰胺凝胶常规灌制于两块封闭的平板之间，然后进入垂直电泳。,（一）SDS聚丙烯酰

5、胺凝胶电泳原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率高是因为其分离效应除了电荷效应、分子筛效应外，还具有浓缩效应。 为了达到这种效应，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳大多采用不连续电泳，所谓不连续电泳，指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。其浓缩胶的孔径、缓冲液的pH值和离子强度不同于分离胶的。不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。 并且电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动样品中所含的SDS-蛋白质复合物向前推进。,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸-SDS系统。,浓

6、缩胶的作用原理 样品和浓缩胶均用 pH 6.8的 Tris-HCI缓冲液，电泳缓冲液选用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，有效泳动率很低，氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于其间。 一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子。因此，甘氨酸、氯离子所形成的移动界面压着蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。 由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。,（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

7、原理,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的pH值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。 同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,蛋白质大小与凝胶浓度,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,SDS-聚丙烯酰胺分离胶配方,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶

8、配方,（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,（1）试剂材料 1、30凝胶贮备液：含29（W/V）丙烯酰胺和1（W/V）甲叉双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。 2、10SDS，去离子水配制，贮存于室温中 3、TEMED 4、10过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4贮存一周； 5、浓缩胶电泳缓冲液 Tris-HCl（pH6.8）。分离胶电泳缓冲液Tris-HCl（pH8.8 ）,（二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,6、电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 （pH8.3）7、上样缓冲液： 100mmol/L Tris-Cl （pH6.8） 200mmol/L -巯基乙醇 10%SDS 0

9、.2%溴酚兰 20%甘油 8、蛋白样品（ENA）：用pH7.4 0.01M PBS从牛胸腺 丙酮粉中抽提，浓度为5mg/ml，-70保存备用。9、垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴 头、EP管、吸管等。10、考马斯亮蓝染液、丽春红染液。,（二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,（2）操作 1、玻璃板准备：依次用水、10SDS、H2O、乙醇和 水冲洗，干燥。 2、配制分离胶：总量5ml，其中： 水 1.6ml 30丙烯酰胺溶液 2.0ml 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 1.3ml 10SDS 0.05ml 10过硫酸铵 0.05ml TEMED 0.002ml,（

10、二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,灌制分离胶 隔绝空气,灌好后一般室温放置3040分钟,（二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,3、配制浓缩胶：总量2ml，其中： 水 1.4ml 30丙烯酰胺溶液 0.33ml 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8)） 0.25ml 10SDS 0.02ml 10过硫酸铵 0.02ml TEMED 0.002ml 将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子， 应小心避免气泡。,（二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,灌制积层胶 插入梳子,（二）SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,4、加样：将蛋白样品（

11、ENA）与上样缓冲液等体积混合，煮沸3-5min后，将其加入梳孔内（根据自己的设计上样），每孔20l。也可根据自己的设计上样。 5、电泳：开始时80V恒压跑浓缩胶，当溴酚蓝压缩成一条线并进入分离胶后把电压调为100V，继续电泳直到溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。 6、染色：取下凝胶，切下一部分用考马斯亮蓝染液染色，其余用于电转移。,（3）SDS-PAGE胶制备注意事项,过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4放置23天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整TEMED的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太

12、快会导致胶面不平。 插梳子的时候要用力均匀，一次成型。,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤,二、电转移,（一）电转移原理 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。,（二） 电转移方法步骤 （1）材料 转移缓冲液、转移电泳槽、电泳仪、稳压器、NC膜、Whatman3MM滤纸、海绵等,（2）方法 1、剪6块滤纸和一块NC膜，其大小应与SDS凝胶的大小相同。如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中会形成短路。 2、将剪好的3MM滤纸及NC膜在转移缓冲液中浸泡35分钟。,3、按下列过程安装转移装置： （1）将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架

13、上放一块海绵。 （2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，依次放置NC膜、凝胶、另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。 （3）最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。,4、接通电源，电压40V，电流0.17-0.2A，转移1.5-6小时，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。 5、转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，取下NC膜放一张干净滤纸上室温下晾干，切下一小部分NC膜，丽春红染色观察转印情况。 6、余下的NC膜用1的牛血清白蛋白（BSA）4过夜封闭。,（

14、3）转膜注意事项：,PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡20分钟。 膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。 转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。,（二）电转移,（4）膜的封闭,为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理，一般用5的脱脂奶粉或者1的BSA室温或37封闭2小时。,Protein,Protein,三、酶免疫定位,转好膜的蛋白,（一）固相酶免疫测定原理,Protein,P

15、rotein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,封闭,（一）酶免疫定位原理,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,Primary Antibody,（三）固相酶免疫测定,一抗孵育,（一）酶免疫定位原理,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,Secondary Antibody,二抗孵育,（一）酶免疫定位原理,Protein,Prot

16、ein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,Secondary AntibodyEnzyme (E),s,s,s,s,s,P,P,P,P,Substrate,显色,（一）酶免疫定位原理,较常用的显色方法有： 固相酶免疫定位显色法 辣根过氧化物酶作用于DAB底物直接显色褐色 酶免疫化学发光显色法 是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理，将结果记录下来。,（一）酶免疫定位原理,科学的对照 蛋白Marker：预染

17、或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪 阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率 阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性 内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果,（一）酶免疫定位原理,蛋白Marker,（一）酶免疫定位原理,（二）酶免疫定位方法步骤,（1）材料 1、洗涤液：含0.05