丹参单体对TNF α诱导大鼠动脉平滑肌细胞MCP 1和IL 1β的影响

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减丹参单体对TNF- a诱导大鼠动脉平滑肌细胞MCP-1和IL-1 B的影响（作者：单位：邮编：）作者：姜希娟 赵桂峰 卢斌，杨 琳 范英昌【摘要】目的 观察丹酚酸B和丹参酮H A对肿瘤坏死因子（TNF-a） 诱导的血管平滑肌细胞（SMC白细胞介素-1 p（ IL-1 B）和单核细 胞趋化蛋白-1 （ MCP-1的影响，探讨丹参单体抗动脉粥样硬化（AS 的作用机制。方法 体外培养大鼠主动脉SMCRT-PC法检测SMCMCP-1 mRNA勺表达；放免法检测 SMC培养上清IL-1 B的水平。结果TNF- a促进SMC MCP-1mRNA表达，提高IL-1 B水平

2、（P值均0.01）。两 种丹参单体均抑制上述因子的表达， 其中，对于抑制MCP-1mRN的表 达以丹参酮H A效果更佳。结论 丹参单体抗AS作用的机制之一是抑 制炎症相关因子的表达，丹参酮H A抗炎效果优于丹酚酸Bo【关键词】肿瘤坏死因子；单核细胞趋化蛋白1;白细胞介素-1B;丹酚酸B ;丹参酮H AEffect of salvia miltiorrhizamonomer on expression ofmono cyte chemotactic protei n-1 and in terleuk in-1 3 in cultured rat vascular smooth muscle ce

3、lls in duced by tumorDOC格式论文，方便您的复制修改删减n ecrosis factora【Abstract Objective To observe the effect of salvianolicacid B and tanshinone II A on monocyte chemotactic protein-1andinterleukin-13 in cultured smooth muscle cells induced byTNF-a and to investigate the molecular mechanism of salvia miltiorrh

4、iza monomer against atherosclerosis.Methods Rat aortic smooth muscle cells (SMC) werecultured , the mRNAexpressio n of MCP-1 was observed by RT-PCR. I nterleuki n-13was measured by radioimmune assay methods.Results The expression of MCP-1 mRNA was stimulated by TNF- a and IL-1 3 was sig ni fica ntly

5、 in creased (P0. 01 ) . Both of the salvia miltiorrhiza monomer markedlyreduced the expression of MCP-1mRNAind IL-1 3, compared with control group(P0. 01 and P 0.05 respectively ).Tanshinone I A had better effect in the expressi on of MCP-1 mRNA tha n salvia nolic acid B. Con clusi on One of the mol

6、ecular mecha nism of salvia miltiorrhiza mono mer resists atherosclerosis was in hibiti onexpressi onofinflammation-relatedfactor in SMC.Tanshinone I A had bettereffect in anti-inflammation than salvianolic acid B.【Key words tumor necrosis factor a； monocyte chemotactic protein-1 ; interleukin-13； s

7、alvianolic acid B; tanshinone丹参是临床防治动脉粥样硬化（AS的常用药物，它含有多种有效 成分，可以通过不同途径达到防治 AS的目的。但是，丹参成分复杂， 主要分为水溶性成分和脂溶性成分，推测不同有效成分的靶点有所不 同。其中丹酚酸B是其主要水溶性成分，而丹参酮H A是其主要脂溶 性成分。为了阐明二者抗 AS的作用靶点，我们用体外培养的大鼠主 动脉平滑肌细胞（SMC）观察丹酚酸B和丹参酮H A对TNF-a诱导的 IL-1 B和MCP-啲影响，为其抗AS作用提供新的理论依据。1材料1.1 主要试剂DMEM/F12培养基（GIBCO、胎牛血清（GIBCO、VSMC a

8、-actin单克隆抗体（日本长野癌症研究中心惠赠）。总RNA提取试 剂盒、1OObp DNA LADDER清华天为时代）、MCP-1引物（中科院华 大基因公司）、B actin弓I物、RT-PCR式剂盒（大连宝生物公司）、 IL-1 B放免分析试剂盒（北京东亚放免技术研究所）。1.2主要仪器和设备超净工作台、CO2恒温培养箱（TC 2323美国 SHLAB、酶标仪（TACAFSPECTRAI ）、倒置显微镜（XD-10198010）、 PCR仪（HYBAID、核酸蛋白分析仪（DU530 BECKMAN台式高速离 心机（HERAEU公司biofuge ）、电泳仪（DYY-III-8B 北京六一仪

9、器 厂）、Bio imaging system （SYNGEN公司）丫 放射免疫计数器（GC-400 型，中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）等。1.3实验用药 丹酚酸B、丹参酮H A （标准品，科翔生物科技有限 公司）和大鼠TNF-a（英国PEPROTEC公司）。2方法DOC格式论文，方便您的复制修改删减2.1大鼠动脉平滑肌细胞培养与鉴定 选用清洁级 Wistar大鼠，雌 雄不限，体重150g左右（购于军事医学科学院四所）。动物脱臼处死， 无菌条件下将主动脉取出，立即放入 D-hanks液中，洗去残留血迹， 剔除血管外膜纤维脂肪层，刮除内膜，并反复冲洗血管。将血管剪成 1mm2左右

10、小块，均匀接种于25cm2培养瓶内，37C恒温培养箱内干 孵1.52h后，每个培养瓶内加入5ml含20%胎牛血清的DMEM/F2 培养液。培养5天后细胞从组织块内长出，并更换新鲜培养液继续培 养，10天后，细胞长成“峰”、“谷”交错的致密细胞层时，进行传 代。实验采用第四代细胞。鉴定：根据细胞形态（典型的梭形，可重 叠生长至多层，高低起伏形成“峰”、“谷”交错状）和VSMCa -actin 免疫组化染色（培养细胞呈明显的胞浆阳性表达）。2.2造模及分组方法 取生长良好的平滑肌细胞，换用无血清培养基 培养12h,进行同步化后，分别进行如下处理。2.2.1 正常组（N）采用无血清培养基继续培养 8

11、h。2.2.2 模型组（M）采用无血清培养基继续培养2h后，再加入10ng/ml TNF- a 作用 6h。2.2.3 丹酚酸B组（B）加入1mg/L丹酚酸B预处理2h后，再加入10ng/ml TNF- a 作用 6h。2.2.4 丹参酮H A组（H A） 加入2mg/L丹参酮H A预处理2h后， 再加入10ng/ml TNF- a作用6h。2.3.1 RT-PCR 法检测动脉平滑肌细胞 MCP-1 mRN的表达2.3指标检测DOC格式论文，方便您的复制修改删减231.1 总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法（AGPC ,A260/A2801.8，RNA置于-70 C备用。2.3.1.2 逆转录反

12、应（RT 从-70 C取出RNA进行反应。参数：42C、30min, 99C、5min, 5C、5min。231.3 PCR 反应 引物序列，看家基因B act in，上游引物5TTGTAACCAACTGGGACGATATGG , 下游弓I 物 5GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG MCP-1, 上 游引物 5 CAGGTCTCTGTCACGCTTCT下游弓 I物 5 AGTATTCATGGAAGGGAATAG 3。参数：94C预变性 2min, 94 C、30s, 55C、30s, 72C、1min, 30次循环。2.3.1.4 MCP-1mRNA表达分析 各样品取10卩l P

13、CR扩增产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果拍照（图 1）保存并在Bioimaging凝胶成 像系统上进行吸光度扫描（IOD）分析，以各样品MCP-1条带IOD和 相应的B -actin 条带的IOD比值表示MCP-1mRN表达的强弱。2.3.2 培养平滑肌细胞上清IL-1 B水平的测定 取细胞上清液采用放射免疫平衡法测定 IL-1 B水平，操作按试剂盒说明书进 行。2.4统计学方法SPSS11.0进行方差分析，组间比较，q检验。3结果3. 1 丹参单体对TNF-a损伤血管平滑肌细胞 MCP-1 mRN表达的影响 通过RT-PCR发现：TNF-a诱导SMC MCP-1 mRN表达，与对照组相比差

14、异有显著性，P0.01。丹参酮H A和丹酚酸B对上述因子的表达存在显著性抑制作用，与模型组相比， P值分别0.05和0.01。其 中，丹参酮H A对MCP-1 mRN表达的抑制作用强于丹酚酸 B, P0.05（表1,图1）。图1各组平滑肌细胞MCP-1mRNA勺表达（由左向右：N B MA）表1丹参单体对 TNF-a损伤SMC MCP-1 mRN表达的影响 （略）注：与模型组比较：*P0.01 , *P0.05 ；与丹参酮H A 组比较， P0.053.2丹参单体对平滑肌细胞炎症介质IL-1 B的影响 结果显示，TNF- a诱导SMC IL-1 B表达，与对照组相比差异有显著性， P0.01。

15、丹参 酮H A和丹酚酸B降低SMCt清IL-1 B水平，与模型组相比，P值分 别0.05和0.01 ,丹参酮H A和丹酚酸B之间差异没有显著性，P0.05（表2）。表2丹参单体对平滑肌细胞炎症介质 IL-1 B表达的影响（略）注：与模型组比较，*P0.01 , *P0.054讨论AS被视为一种特殊类型的炎症，单核细胞粘附于血管壁并穿入内皮下形成泡沫细胞是其重要形态学特征。单核细胞进入血管内膜下是AS早期事件并贯穿其全过程，MCP-1是介导上述过程实现的主要因子:2, 3。MCP-1在正常血管壁中几乎未表达，而在 AS不同演变时期中MCP-1表达均有升高。虽然在正常情况下，SMC不产生MCP-1

16、但是在AS发展过程中，SMC 不仅可作为MCP-1的效应细胞，而且还可自行合成与分泌 MCP-1而影 响其他细胞的功能4。动物实验发现5,不同阶段AS病变组织 中均有大量 MCP-1mRN表达，其中VSMC3 MCP-l及MCP-1受体 mRNA表达呈阳性；并且随着病变时间延长、病变程度加重，MCP-1蛋白及其mRNA勺表达均逐渐增强。MCP-1是VSMC勺促分裂因子，它通过PKC 或增强细胞外Ca2+内流而促进VSM（增殖和迁移6。在病理状态多 种物质及细胞因子（如IL-1 B）可以诱导SMC分泌MCP-1从而直接 或间接地参与AS形成。而吴强7等用逆转录病毒表达载体介导反 义MCP-1转基

17、因表达，能减少MCP-1表达并抑制单核细胞在动脉内膜 粘附，为AS防治提供了一个新的研究线索。另外，VSMC可通过自分泌和旁分泌方式释放细胞因子IL-1 ,而且IL-1 B的水平远高于IL-1 ao IL-1 B具有多种生物学功能，它不仅 能作用于血管内皮细胞，诱导其 MCP-1和VCAM-啲表达，而且能与 PDGF或单核细胞源性生长因子共同作用促进 VSMCf生。以浓度和时 间依赖方式诱导单核细胞和中性粒细胞对 VSMC勺粘附8。动物实 验表明IL-1 B对兔主动脉VSMC MCP-的蛋白分泌和mRNA表达具有 明显的诱导作用 9。因此，推断IL-1 B的表达增加可以间接促进 MCP-1的表

18、达。本实验离体培养大鼠VSMC米用炎症反应主要调节因子 TNF-a进行 干预，通过 RT-PCR法检测发现 SMC MCP-1mR表达增加，SMC培养 上清IL-1 B水平升高，与以往报道相一致5。丹参酮H A和丹酚酸 B对上述因子的表达具有明显抑制作用，其中以脂溶性成分丹参酮H A的效果更好。另外，通过放免法发现，两种丹参单体对 IL-1 B也有 抑制效应，而且与对MCP-啲影响相一致，推断丹参单体可能通过抑 制IL-1 B达到间接抑制 MCP-1的目的。由此可见丹参单体具有抑制炎症因子表达的作用，其抗 AS的机制之一可能是通过抑制炎症反应 达到抑制SMC增殖和单核细胞趋化等效应，达到减缓A

19、S发生发展的目的；结果同时提示丹参成分复杂，其不同成分对上述炎症因子的影 响不尽相同，其中以脂溶性成分丹参酮HA的效果更好。【参考文献】1李俊峡.作为炎症性疾病的冠状动脉硬化.日本医学介绍，2005, 26(6):278.2 DeGrabaTJ, Sire n AL, Pe nix L,et al. In creased en dothialial expression of intercellular adhesion molecule21 in Symptom2atic versus asymptomatic humancarotid atherosclerotic plaque. Str

20、oke , 1998 , 29 (7): 1405-1410.3 O Brien KD , Allen MD , Mcdonald TO, et al.Vascular celladhesi on molecule21 expressed in huma n coronary atheroscleroticplaques: inplication for themode ofprogression of advaneed coronary atherosclerosis. J Clin In vest , 1993 , 92 (2): 945-951.4 Nelken NA, Coughlin SR, Cord on D , et al.Mo no cyte chemoattractant protein-1 in humanathermatous plaques.J Clin