（推荐）4-PCR技术

1、1,2,PCR技术 (1)概念：在_快速扩增_ _的实验技术称为PCR技术。 (2)物质条件 体外进行DNA复制的各种组成成分有：_、_ _、_、_。 (3)PCR的反应过程 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为_ _和_(72 左右)。,体外,特定基因或DNA序列(目的DNA,片段),DNA模板,四种,脱氧核苷酸,Taq聚合酶,引物,变性,(94 )、退火(4060 ),延伸,3,4,细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较,1,5,6,引物设计原则,1、引物决定着扩增的特异性和扩增的效率 2、引物设计影响到后续载体构建的效率 3、引物设计影响到实验的成本 引物设计软件

2、Primer premier 4.11 Oligo 6.0,7,数量：2个（一对） 长度 一般在1630个核苷酸，至少为16个核苷酸，不超过38个 指与模板链完全配对的碱基数 太短：特异性差 太长：自身折叠形成二级结构； Tm过高，不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始二级结构。,引物设计原则,8,顺序 应是所要扩增基因特异的顺序 若要进行个体间的比较，应选择保守同一的顺序来设计引物 碱基组成 GC为4060 ATGC最好随机分布,引物设计原则,9,防止引物自身形成二级结构 一对引物的顺序不应自身互补 特别要避免3-端的重叠，以免形成二聚体等特异的扩增条带 防止发卡结构 、茎环结构 ！,引物设

3、计原则,10,下图为某一次循环的产物，请据图回答问题。,【巩固1】,(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为_、_、_三个步骤。 (2)DNA的羟基(OH)末端称为_，图中所示的羟基端为_(填字母)。 (3)PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用_使双链间氢键断裂，而PCR技术利用_原理，使双链氢键断裂。以引物为标识，可判断出此产物最早为第_次循环的产物。,11,聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术的叙

4、述，不正确的是 ()。,【巩固2】,APCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术 B反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板 CPCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增 D应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变,12,聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历30多次下述循环：94 条件下使模板DNA变性、解链56 条件下退火(引物与DNA模板链结合)72 条件下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是 ()。,【例1】,13,A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键， 也可利用解旋酶实现

5、 B退火过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补 配对原则完成的 C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、4种核糖核苷酸 DPCR与细胞内DNA复制相比，其所需要酶的最适温度 较高 思维导图：,14,下列有关PCR技术的叙述，不正确的是()。 A又称聚合酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段 的技术 B在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内 DNA的复制类似 CPCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及 四种脱氧核苷酸 DPCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退 火、延伸,【变式拓展1】,15,进行目的DNA片段的体外扩增，下列选项不需要的是 ()。 ADNA

6、聚合酶 B解旋酶 CMg2 D引物 解析DNA体外扩增是利用的DNA热变性原理，不需解旋酶。 答案B,【变式拓展2】,16,下列关于DNA复制叙述中，正确的是 ()。 ADNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸 DNA链 BDNA复制不需要引物 C引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 DDNA的合成方向总是从子链的3端向5端延伸 解析本题主要考查了DNA聚合酶的作用特点。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链。由于模板链首先复制的是3端，即复制方向35，而DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向从子链

7、53。 答案C,1.,17,PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上是一种能自动调节温度的仪器。下列对PCR过程中温度的控制的说法错误的是 ()。 A酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链 B延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性的温度 C要用耐高温的DNA聚合酶 D需要耐高温的解旋酶 解析PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性。 答案D,2,18,A向右的过程为加热(80100 )变性的过程 B向左的过程是DNA双链迅速制冷退火 C变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同 D图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3端 解析变性后的DNA在缓慢降温

8、后才会退火；变性与在生物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一DNA片段都有2个游离的磷酸基(5端)和2个3端。 答案A,下图为DNA变性和退火示意图，下列相关说法正确的是 ()。,3,19,PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链做模板时将 ()。 A仍与引物结合进行DNA子链的延伸 B与引物结合进行DNA子链的延伸 C同时与引物和引物结合进行子链延伸 D无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链 解析此题考查同学们对PCR反应中的变性、退火、延伸的实质能否真正理解。当由引物延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物结合延伸DNA子链。 答案B,4,20,在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。,5,21,(1)在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。 (2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。 (3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一