doc 遗传标记技术及其在林木遗传育种中的应用研究

1、遗传标记技术及其在林木遗传育种中的应用研究第18卷第5期2005年10月世界林业研究worldforestryresearchvo1.18no.50ct.2005遗传标记技术及其在林木遗传育种中的应用研究王晓丽马祥庆.(1西南林学院,昆明650224;2福建农林大学林学院,福州350002)摘要:论述了不同遗传标记技术的原理及特点,综述了遗传标记技术在林木遗传育种中的应用研究进展,为林木遗传学和育种学的研究提供参考.关键词:遗传标记,林木,遗传育种,分子标记中图分类号:$718.46,$722,3文献标识码:a文章编号:10014241(2005)0500375advancesingeneti

2、cmarkersanditsapplicationinforesttreebreedingwangxiaolimaxiangqing.(1southwestforestrycollege,kunming650224,china;2collegeofforestry,fujianagricultureandforestryuniversity,fuzhou350002,china)abstract:geneticmarkersareessentialtoolsofevaluatingandselectinginterestinggenesandhadbeenextensivelyappliedi

3、nthegeneticsandbreedingresearch.theprincipleandcharactersofgeneticmarkerswerediscussedandtheresearchadvancesingeneticmarkersinforesttreebreedingwereanalyzed.keywords:geneticmarkers,foresttree,geneticbreed,molecularmarkers遗传标记(geneticmarkers)是指与目标性状紧密连锁,与该性状共同分离且易于识别的可遗传等位基因变异n.遗传标记不但在遗传学的建立和发展过程中起着重

4、要作用,同时也是生物遗传育种的重要工具.随着遗传学的发展,遗传标记已经历了形态学,细胞学,生化和分子标记4个主要发展阶段,并在林木遗传育种中得到了广泛的应用.本文在对目前国内外不同遗传标记技术的原理及其特点进行论述的基础上,综述了遗传标记技术在林木遗传育种中的应用研究进展,为林木遗传学和育种学研究提供参考.1遗传标记技术1.1形态标记技术传统的形态标记是指一种肉眼可见的外部特征.从广义上讲,形态标记还包括与色素,生理特性,抗虫性等有关的标记.大多数形态标记具有典型的形态特征,比较容易识别和观测,因而便于确定他们与其性状的关系.形态学是研究植物分类及系统进化的基础,传统的品种鉴定是根据种子,幼苗

5、及植株的形态特征和经济性状进行分类鉴定的,这样的鉴定具有直观,快速,简便,可靠的优点.但是能够用作遗传标记的形态标记数量极少,且有些形态标记与其他有害或不利性状相连锁或具不良的多效性;同时植株的鉴定也受到发育阶段的影响,有些种类,类群或品种其特定的形态特征只有在特定的发育阶段才会表达;形态标记多态性差,数量性状易受环境条件的影响.由于这些方面的原因造成利用形态标记进行植物种系发生,亲缘关系研究及品种鉴定困难重重.1.2细胞学标记技术细胞学标记是随着细胞遗传学发展起来的,其主要是依据染色体核型(染色体数目,大小,随体,着丝点位置等)和带型(c带,n带,g带)的鉴定对物种进行研究.细胞学标记虽然克

6、服了形态标记易受环境影响的缺点,但这种标记的产生需收稿日期:2oo41124基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371153);福建省科技厅重大科学基金项目(20031004)马祥庆为通讯联系人.email:38世界林业研究第l8卷要花费大量的人力物力进行培育和选择,一些物种忍受染色体结构和数目变异的能力较差而难以获得相应的标记材料,所以这类标记的数目也很有限.另外,某些物种虽有标记材料,但常常伴随着标记对生物有害的表现型效应,有时观测和鉴定比较困难.1.3生化标记技术生化标记是目前应用较多的鉴定方法,它直接鉴定基因的表达产物,主要是同功酶.酶是结构基因编

7、码的直接产物,它作为基因的标记比形态特征更能直接地反映遗传信息.同功酶基因的表达通常为共显性,无上位作用,等位基因无显隐性之分,但都有表现型,因而通过同功酶分析能够较直接地判断基因的存在及其表达规律,比较不同对象之间的基因差异.但是由于表现出位点多态性的同功酶的种类比较少,所以在植物的群体研究中同功酶标记有其局限性.1.4分子标记技术分子标记是继形态标记,细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式.广义的分子标记是指可遗传的并可检测的dna序列或蛋白质.狭义的分子标记是指dna标记.分子标记技术大致可以分为4类:以分子杂交技术为核心的一类分子标记;以分子杂交技术和pcr技术为核

8、心的一类分子标记;以pcr技术为核心的一类分子标记;以pcr技术和测序为核心的一类分子标记.1.4.1以分子杂交技术为核心的一类分子标记原位杂交原位杂交技术(insituhybridization,ish)是gall和pardue(1969)首次提出的,基本原理是:利用标记的dna或rna探针直接在染色体,细胞或组织水平定位特定靶核酸序列,并经一定的检测手段把该待测核酸在染色体上的位置显示出来.原位杂交技术的优点是:可以用来定位多拷贝和大片段单拷贝dna序列;可从用来鉴定外源染色体或染色体片段_2;可以进行植物基因组作图和进一步的染色体组成和特异性分析以及基因定位的研究,目前已有

9、较多相关的研究报道口.原位杂交技术的缺点是:制片的难度较大,原位杂交技术所需的dna样品量大,杂交步骤过于繁琐,费用较高.kflprflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)为限制性片段长度多态性,是至今仍然普遍使用的dna标记.其基本原理是:用限制性内切酶酶切基因组dna,产生许多大小不等的dna片段,然后用化学分光剂或同位素标记过的dna作探针,把与被标记dna相关的片段检测出来,从而检测所研究样品的多态性.它的核心技术是酶切和southern杂交.rflp的优点是:rflp标记具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好.缺点是:rfl

10、p标记必须经过southern杂交,费时,费力,周期长;每次检测的位点少;对dna需求量大(510ug);要用放射性同位素标记探针;探针的种属特异性较强.dna芯片dna芯片(dnachip)是1991年由美国的一家新兴生物技术公司发展起来的.其基本原理是:利用特异性探针与目的dna杂交,从而检测目的dna.dna芯片技术在基因诊断,基因表达研究,基因组研究,发现新基因及病原体的诊断等生物医学领域有巨大的应用潜力.其优点是:dna芯片由于同时将探针固定于支持物上,可以一次性对样品大量序列进行检测和分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂,自动化程序低,操作序列数量少,检测效率

11、低等不足,而且通过设计不同的探针阵列,使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值.dna芯片的缺点是:技术成本昂贵,复杂,检测灵敏度较低,重复性差,分析范围较狭窄等.1.4.2以分子杂交技术和pcr技术为核心的一类分子标记原位pcr原位pcr(insitupcr)是传统pcr和原位杂交技术相结合的产物.其基本原理包括:通过酶消化来预处理核膜;通过带有互补末段的多重引物进行扩增;反应结束后,将细胞离心沉淀在载玻片上,再对扩增产物进行原位检测.现已在外源基因检测,基因变异的鉴定和基因表达研究等领域得到广泛应用.原位pcr的优点是:具有高效,所需样品dna量少,易于自动化和精细

12、定位等特点;在原位检测低拷贝基因及基因低水平的表达等方面有其独特的优越性.缺点是:它仍然具有第5期王晓丽马祥庆:遗传标记技术及其在林木遗传育种中的应用研究39分子杂交在技术上的一些不足,在应用方面受到一定的限制.mrna差别显示mrna差别显示(mrnadifferentialdisplayreversetranscriptionpcr,ddrtpcr)最早出现于1992年,其基本原理是:利用真核生物mrna具有polya尾的特点,设计相应的锚定引物逆转录合成cdna第一链,再以cdna链为模板进行pcr扩增,电泳分离扩增产物,即可检测到正常与异常细胞间差别cdna片段.该方法适

13、合于比较不同细胞系和不同组织间,同一细胞系和同一组织内在不同条件下基因表达的差异ls.优点是:rna用量少;操作简便,快捷;灵敏度高;可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的细胞内mrna样品.缺点是:假阳性和短小差异片段的频率较高.1.4.3以pcr技术为核心的一类分子标记aflpaflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphisms)为扩增片段长度多态性.其基本原理是:dna经限制性内切酶双酶切后,形成随机限制性片段,将特定的接头连接在这些dna片段的两端,通过接头序列和pcr引物3末端的识别而扩增特异性片段,最终通过电泳检测片段多态性.该方法适

14、用于植物遗传连锁图谱和无性系或品种指纹图谱构建,数量性状定位,基因表达等研究领域.优点是:aflp既有rflp的可靠性,也有rapd的方便性;多态性丰富;共显性表达;dna用量少;灵敏度高;快速高效等.缺点是:实验成本较高,试剂盒价格较昂贵;需要用同位素检测;基因组的不完全酶切影响实验结果.alpalp是以随机引物pcr扩增为基础的几种标记方法的总称,包括rapd(randomamplifledpolymorphicdna,随机扩增多态性dna),appcr(arbitrarilyprimedpcr,随机引物pcr)和daf(dnaamplifiedfingerprinting,

15、dna扩增指纹)3种.其基本原理是:采用随机设计的单个引物进行pcr扩增,产物经凝胶电泳分离后观察即可.alp的优点是:单个反应能获得更多的信息;实验步骤和分析过程简单,快速;dna用量少.isskissr(intersimplesequencerepeat)为简单序列重复间区.其基本原理是:用根据简单序列重复而设计的寡核苷酸引物来检测2个ssr之间的一段短dna序列的差异.如果基因组在扩增区域内发生变化,就会使扩增的片段大小和数量改变,通过电泳即可检测出基因组在这些ssr位点的多态性.issr的优点是:issr是在ssr和rapd基础上发展起来的,具有多态性水平高,dna用量少

16、,成本低廉,重复性好的特点.缺点是需要专门设计引物.1.4.4以pcr技术和测序为核心的一类分子标记stssts(sequencetaggedsite)为特定序列位点.其基本原理是:sts为基因组中只出现一次的一段长度为200500bp的序列所界定的位点.需要先测序,设计引物,再进行pcr,然后可以用限制性内切酶酶切sts扩增产物,以显示多态性.sts的优点是:为共显性标记;具有rflp标记的稳定性,重复性;具有pcr技术的dna用量少,自动化程度高的特点;可适用于大群体分析;实用性强.缺点是:sts的开发依赖于测序,引物合成和序列分析成本太高.sapsap(spe

17、cificampliconpolymorphism)是特异扩增多态性,包括scar(序列特异性扩增区),caps(酶切扩增多态性序列),erpar(延伸随机引物扩增区域多态性)标记.其基本原理是:通过rapd或rflp标记转换产生.sap的优点是:从rapd或rflp转换成的sap标记,一方面解决了rapd,扩增片段多和重复性较差以及rflp实验过程繁琐等方面的问题;另一方面sap为共显性标记,可以检测单个碱基的突变,在跟踪和鉴定目的基因中有一定的优势.缺点是需要专门测序.2不同遗传标记在林木遗传育种中的应用研究2.1林木群体遗传变异研究遗传标记可以提供大量的遗传变异信息,是40世界林业研究第

18、18卷进行群体遗传结构和育种群体遗传关系研究的有力工具.现已有多种标记技术被用于此方面的研究,如利用形态标记对马尾松种源进行聚类等级划分_8,研究马尾松种源地理变异规律;利用细胞标记进行马尾松种源核型比较;利用生化标记研究杉木群体遗传多态性i1妇和马尾松天然群体遗传变异_l.由于分子标记具有高多态性,选择中性和不随环境条件而改变的优点,使它成为林木遗传变异研究的有力工具,目前已有多种分子标记技术用于此方面研究.在物种起源和系统进化研究方面,如利用rapd标记研究中国枣的种下划分i1,麻核桃起源与分类地位,桦树种间亲缘关系il,毛白杨起源等.在群体结构和遗传多样性方面,利用rapd标记对杉木种源

19、_l,马尾松种群il遗传多样性进行研究;利用rapd标记对大青杨天然群体遗传结构的研究;利用rflp标记对马占相思_2等的研究;利用aflp标记对细叶桉和蓝桉_2等的研究;利用ssr对巨桉和尾叶桉等的研究;利用叶绿体微卫星分析研究杉木和秃杉天然群体的遗传变异和系统进化.2.2林木指纹图谱研究dna指纹图谱是指特定dna样品通过分子标记技术所显示出来dna片段的总称.dna指纹图谱的构建对物种基因型或品种分析,杂种和无性系鉴定具有重要意义.在林木基因型或品种,无性系分析方面的研究较多,如利用rapd标记构建尾叶桉和细叶桉指纹图谱,鉴定杉木无性系_2.利用rflp标记对红云杉和黑云杉进行树种和种源

20、水平的鉴定i2;利用aflp标记鉴定板栗品种i2.还有用分子标记检测林木杂种真实性及花粉污染,如利用rapd标记检测加拿大黄桦杂交时的花粉污染i2;利用叶绿体dna变异提供的遗传标记鉴定松属和云杉属的杂交种.2.3林木基因组研究分子标记是遗传连锁图谱构建的有效工具,随着人类基因组计划的研究,大大推动了林木基因组研究的发展,已构建了许多林木树种的遗传连锁图谱.如利用aflp标记构建了火炬松的遗传连锁图谱.;利用rapd标记构建了美洲黑杨青杨_3的遗传连锁图谱;利用rflp标记构建了火炬松的遗传连锁图谱.遗传连锁图谱的构建为基因组结构和功能分析提供了有力工具.分子标记已用于林木多个树种重要经济性状

21、的qtl定位研究.如对杉木生长性状_3,火炬松木材比重和抗旱胁迫i3,湿地松抗松梭锈病等数量性状基因位点定位研究.qtls定位研究如果找到紧密连锁的标记,就可以直接用分子标记辅助进行育种策略制定和目标性状早期选择,从而缩短育种周期,加速林木遗传改良工作的进程.林木遗传连锁图谱构建和数量性状位点定位研究为目的基因克隆提供了方便.由于林木中目的性状与连锁标记间的距离较大,还没有成功克隆的报道,但随着高密度遗传连锁图谱的构建,以图谱为基础的目的基因克隆将会很快实现.2.4林木辅助育种研究开展分子标记辅助选择育种可以使选择直接基于dna水平上,弥补常规手段育种的一些不足,大大提高了选择的可靠性,并有助

22、于克服林木世代长带来的局限性,缩短育种周期3,对种质资源管理具有重要意义.如利用rapd标记研究杉木杂交亲本遗传变异与子代生长相关性3.基于遗传连锁图谱和qtls定位对林木进行辅助选择育种,如火炬松木材比重,美洲栗抗病_3等研究.各种分子标记为林木育种提供了有价值的参考和极大的方便,将极大地提高育种的目的性,精确性,缩短育种周期,提高育种效率.理想的遗传标记需要达到以下几个要求:具有高度的多态性;共显性遗传,即利用分子标记可以鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;能明确辨别等位基因;遍布整个基因组;除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;选择中性,即无基因多效性;检测手段简单,快速;开发

23、成本和使用成本尽量低廉;在实验室内和实验室间重复性好,便于数据交换.但目前还没有一种分子标记能满足以上所有的要求.在林木遗传育种的实际应用中选择哪几种方法,应视实际情况而定.因为对同一项研究而言,不同的方法可能会产生不同的效果.而且不同方法的实验成本大小和费时费力程度也会有很大的差别.因此在实际应用中可以根据具体研究方向,第5期王晓丽马祥庆:遗传标记技术及其在林木遗传育种中的应用研究41结合各种分子标记的特点,实验的时间和成本,合理地选用不同的标记方法.参考文献1贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种.中国农业科学,1996,29(4):1102王玲,宁顺斌,宋运淳,等.荧光原位杂交技术的

24、应用和展望.植物,2000,42(11):110111073李立家,宋运淳,鄢慧民,等.染色体定位两个与玉米大斑病抗性基因htl连锁的rflp标记.植物,1998,40(12):109310974陈林姣,缪颖,陈德海.原位pcr技术及其应用.生物工程进展,2000,20(2):58635崔大祥,闫小君,苏成芝.mrna差异显示pcr的进展.生命的化学,1997,17(4):39416吴敏生,戴景瑞.aflp标记与玉米杂种产量,产量杂种优势的预测.植物,2000,42(6):6006047littm,lutyja.ahypervariablemicrosatelliterevealedbyinv

25、itroamplificationoffldinucleotiderepeatwiththecardiacmuscleactiongene.amjhumgenet,1989,44:3974018傅玉狮.马尾松种源遗传距离聚类分析.福建林业科技,1996,23(1):159张水生.马尾松种源地理变异规律的初步研究.江西农业大学,1999,21(4):59760110韩一凡,杨自湘,佟永昌,等.杉木地理种源核型的研究.林业科学,1984,20(2):11312011施季森,叶志宏,洪菊生.杉木遗传多态性与多基因位点遗传结构.南京林业大学,1993,17(3):91512黄启强,王莲辉,等.马尾松天

26、然群体同工酶遗传变异.遗传,1995,22(2):14215113彭建营,束怀瑞,彭士琪.用rapd技术探讨中国枣的种下划分.植物分类,2002,40(1):899414吴燕民,裴东,等.用rapd分析麻核桃起源与分类地位.林业科学,1999,35(4):253015姜静,杨传平,等.利用rapd标记技术对桦树种间亲缘关系的分析.林业科学,2002,38(1):15415616李宽钰,黄敏仁,王明庥.用rapd探讨毛白杨起源.植物分类,1997,35(1):243117陈由强,叶冰莹,等.杉木地理种源遗传变异的rapd分析.应用与环境生物,2001,7(2):13013318李丹,彭少麟.三个

27、不同海拔梯度马尾松种群的遗传多样性及其与生态因子的相关性.生态,2001,21(3):41542019苏晓华,张绮纹,郑先武,等.利用rapd分析大青杨天然群体的遗传结构.林业科学,1997,33(6):50451120butcherpa,morangf,perkinshd.rflpdiversityinthenucleargenomeofacaciamangiym.heredity,1998,81:2052】321marquescm,araujoja,ferreirajg,eta1.aflpgeneticmapsofeucalyptusglobulusande.tereticornis.th

28、eorapplgenet,1998,96:72773722brondanirpv,brondaniv,tarchinir,eta1.development,characterizationandmappingofmicrosatellitemarkersineucalyptusgrandisande.uroplla.theorapplgenet,1998,97:81682723陈伯望,洪菊生,施行博.杉木和秃杉群体的叶绿体微卫星分析.林业科学,2000,36(3):465124甘四明,施季森,等.尾叶桉和细叶桉无性系的rapd指纹图谱构建.南京林业大学,1999,23(1):l11425黄发新

29、,张新叶,等.运用rapd技术进行杉木无性系识别研究.湖北林业科技,2000,(增刊):l41926bobolams,eckertrt,kleinas.restrictionfragmentvariationinthemuclearribosomaldnarepeatunitwithinandbetweenpicearubensandpiceamariana.canjforres,1992,22:25526327yamamotot,shimadat,kotobukik,eta1.geneticcharacterizationofasianchestnutvarietiesassessedbyaflp.breedingsci,1998,48:35936328roya,franscarian,mackayj,eta1.segregatingrandomamplifiedpolymorp