血管紧张素Ⅱ及其受体AT1、AT2在病理性瘢痕中的作用研究

1、学校代码： 学 号： 四川大学七年制学生学位论文题目： 血管紧张素及其受体、 在病理性瘢痕中的作用研究 作 者 伍晓靖 专 业 外科学 指导教师姓名 岑 瑛教授 二零零五年四月 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 彳 申请人： 指

2、导教师： 血管紧张素及其受体、在 病理性瘢痕中的作用研究 研究生：伍晓靖 导师：岑瑛 中文摘要 目的：通过检测血管紧张素（ ， ）及其受体 （、）在病理性瘢痕和正常皮肤中的表达，初步探讨血管紧张索与病理性瘢痕形成的关系。 材料与方法：由四川大学华西医学中心病理科提供：正常皮肤标本例（取自整形手术切除的正常皮肤），增生性瘢痕标本例，瘢痕疙瘩标本例，肝硬化标本例（阳性对照），共例。用免疫组化测定：及、在正常皮肤及病理性瘢痕中的表达及分布情况。采用盲法观察阳性反应。按染色强度分为级，便于讨论。统计学处理：应用统计软件包进行统计分析。 结果：阳性对照结果呈强阳性，阴性对照结果呈阴性 （）血管紧张素在正

3、常皮肤中的表达呈阴性或可疑阳性，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的表达均呈阳性或强阳性。正常皮肤中的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达有显著性差异（）。而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩二者之间 的表达无显著性差异（）。 （）血管紧张素受体在正常皮肤中的表达呈阴性或可疑阳性，在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩内的表达均呈阳性或强阳性。正常皮肤中的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达有显著性差异（）。而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩二者之间的表达无显著性差异（） （）血管紧张素受体在正常皮肤中的表达呈阴性或可疑阳性，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩内的表达呈阳性或强阳性。正常皮肤中的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达有显著性差异（）。而增生性瘢痕和

4、瘢痕疙瘩二者之间的表达无显著性差异（） 结论： （）血管紧张素在维持皮肤的正常生理功能方面有一定作用。 （）血管紧张素与皮肤病理性瘢痕的形成有关。 （）介导了血管紧张素在皮肤内的大部分功能。 关键词：血管紧张素血管紧张素受体增生性瘢痕瘢痕疙瘩 英文摘要： ， 舀 ： ： （ ） ： ， ： ， 。 、 ： ， （） ， （） （）（） ， （） （）（） ， （） （） ：（） （） （） ： 前言 瘢痕是人体创伤修复中的种自然产物，创伤修复有两种类型，一种类型是皮肤的表浅伤口，仅仅影响表皮，由毛囊、皮脂腺上皮细胞起始，通过简单的上皮形成而愈合，修复后均能达到结构和功能完全恢复。另一种类型是深

5、达真皮和皮下组织的损伤，通过瘢痕来修复。人类大多数的组织损伤通过瘢痕形成来修复。任何类型的生物、生化或物理损伤诱发了体内连锁性的体液一细胞反应，从而导致个以纤维蛋白起主要作用的纤维增生性炎症过程，瘢痕组织就是这种炎症过程的最终产物。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩严重影响着人类的形态、功能、美观及心理，其形成与增生是学者们研究的焦点和难点，针对这一难题已经进行了大量的研究。目前认为，对瘢痕的形成起促进作用的因素可以分成：组织水平（瘢痕分型等方面，还包括组织所处环境）、细胞水平（细胞的分裂、增殖、凋亡、功能行使及细胞环境等方面）、亚细胞水平（超微结构及细胞器功能改变）、基因水平（，一等改变）、水平（、等细胞

6、因子、功能蛋白及受体等的转录变化）、 蛋白质水平（胞膜蛋白、细胞因子等的质与量的变化）。等几个方面来探讨。本课题即是蛋白质水平的研究。 肾素一血管紧张素系统（）是机体调节血管张力和水钠代谢的内分泌系统的组成部分，随血液循环发挥作用，而血管紧张素是系统 的主要活性成分。循环中的主要来自肝脏，肝细胞产生血管紧张素原并释放入血，血管紧张素原在循环中经肾素的裂解作用，由肽转变为肽，从而形成血管紧张素。血管紧张素经转换酶的裂解作用，从末端裂解掉两个氨基酸残基（组一亮）变为肽的血管紧张素。 血管紧张素由于其分子量和结构不同，其生理作用各异。它的生理活性作用于全身，包括： 、调节血压的作用：是强有力的升压剂

7、。其有效作用直接收缩某些 组织的血管床，还可通过影响大脑和交感神经系统而升压。 、促进醛固酮的分泌：大剂量时还可增加皮质醇的分泌。 、对肾的影响：抑制肾索分泌、作用于近曲小管，促进钠的重吸收。 、对内分泌的影响：可刺激或影响血管加压素的分泌。 、对大脑中枢的作用：能直接作用于大脑和垂体，产生明显的 口渴的感觉与思饮要求。 、与其它激素的关系：与皮质类固醇和雌性激素有明显的关 系此二者对血管紧张素原的生成有促进作用。 上述作用的方式都是通过靶细胞浆膜的特异受体和钙离子浓度的介导而发挥生理作用。 除肝细胞外，现已发现体内的其它一些组织器官也能合成，促使组织器官纤维化过程中的局部激活，并可通过多种途

8、径参与器官纤维化的发生。近年的研究发现脑、心肌、肾脏、肺、卵巢、睾丸、肾上腺、颌下腺、血管壁和皮肤等多种组织器官也能合成肾素一血管紧张素系统（）的全部或大部分成分，称为局部（组织型）。组织的内分泌作用机制属于自分泌或旁分泌现象，与循环中系统作用机制不同。其分泌器官既是分泌者，又是巨素一血管紧张素的靶器官。 局部有其一定的生理作用： 、 心脏：增强心肌收缩力、调节心脏冠状动脉血管的张力、刺 激心肌细胞蛋白合成，促进细胞增长。 脑：其突出生理效应是加压作用，有利于脑的供血；刺激下 丘脑口渴中枢，引起饮水行为。 肾脏：类似循环的作用，调节肾血流量和肾小球滤过率； 调节肾小管水、钠重吸收；影响肾脏血流

9、分布。 、 卵巢：调节卵泡发育和排卵、刺激卵泡血管生成。 、 睾丸：作用尚不清楚 、 血管壁：血管舒缩的双向调节作用、刺激血管平滑肌细胞增 殖、促进新生的侧支血管形成。 、 皮肤：动物实验证实可促进皮肤创面的愈合。 除生理作用外，局部也有一定的病理作用。在一些组织器官的纤维化过程中，局部激活，一些成分表达水平升高，表明局部可能参与了组织器官纤维化和或结构重构的过程，这些组织器官包括心脏、肝脏、肺、肾脏和皮肤“。 国外的一些研究表明，在体外培养的人体皮肤细胞中，可以检测到系统几乎所有成分的的表达。并且在受到损伤的皮肤周围， 及其受体的表达增加卅。动物实验证明， 可以促进皮肤创面的修复剐。这些都提

10、示可能在皮肤损伤修复的过程中扮演了一定的角色。而另一些研究发现，在系统性硬化症病人过度纤维化的皮肤中，血管紧张素原的表达增加”。应用血管紧张索受体拮抗剂和血管紧张素转换酶抑制剂能在一定程度上减轻器官纤维化（目前尚未查找到与皮肤纤维化疾病有关的类似研究）。这些都说明在促纤维化方面有 一定作用。综上，皮肤创面修复时出现的病理性瘢痕实际上是皮肤的过度纤维化改变， 可能对这一病变起了促进作用。 本课题旨在研究血管紧张素友其受体、在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的分布情况，并与正常皮肤进行对照，以初步探讨在病理性瘢痕形成中的地位。 实验材料与方法 、实验材料：由四川大学华西医学中心病理科提供。年月至年月期间在烧

11、伤整形科住院或门诊行瘢痕切除的病人的增生性瘢痕标本、瘢痕疙瘩标本蜡块以及行整形手术的病人切除的多余正常皮肤标本的蜡块。 入选标准： （）病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病。 （）病人无全身感染、肿瘤； （）无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未全身应用皮质类固醇激素等药物治疗； （）瘢痕局部无溃疡，一年内未接受注射药物、外用药物及放疗等治疗； （）局部症状典型。 取年至年间在川大华西医院普外科住院行肝移植的肝硬化病人的肝脏标本蜡块供阳性对照。 取得正常皮肤例，增生性瘢痕标本例，瘢痕疙瘩例，肝硬化标本例（阳性对照），共例。在例皮肤及瘢痕标本的提供者中，有男性入，女性

12、人：其中岁人岁人，岁以上人。取材部位：头面部例，胸部例，背部例，四肢例。 、主要试剂：血管紧张素抗体（兔抗人，购自武汉博士德生物工程有限公司） 血管紧张素受体抗体（兔抗人，购自武汉博士德生物工程有限公司） 血管紧张素受体抗体（兔抗人，购白武汉博士德生物工程有限公司） 免疫组化试剂盒（美国公司），包括以下成分： （）过氧化物阻断剂 （）正常非免疫兔血清 （）生物素标记的羊抗兔 （）链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶溶液 溶液（，配） 显色液（自配） 缓冲液（自配） 、主要仪器及设备： 台式振荡器（太仓市科教器械厂） 电热鼓风于燥箱（重庆四达实验仪器有限公司） 隔水式电热恒温培养箱（上海安亭科学仪器厂

13、） 、实验方法： 分组：四类标本共个，每个标本切片张，分别进入组、组和组。每组中分别取正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩标本切片各一张，以溶液代替一抗作阴性对照。 石蜡切片免疫组化染色（法，又称、法）实验步骤、石蜡切片脱蜡： （）二甲苯脱蜡二次，每次分钟； （）梯度酒精：，分钟分钟 ， 分钟，分钟；充分水洗。、过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：置于新鲜配制的：仉内分钟 （室温避光）：附：！的配制国产？，蒸馏水 （染一缸切片）、蒸馏水沈：分钟，两次（置于摇床）；、高压锅抗原修复：置切片于盛有新鲜配制的缓冲溶液（） 的高压锅中，加阀，分钟后去阀，放汽，置入凉水中冷却至室温后， 取出切片，入 （）沈次，每次

14、分钟：、：正常兔血清封闭，。，分钟，减少背景非特异性着色：、弃去血清，直接滴加一抗，室温置放分钟后，置。冰箱过夜：、 洗次，每次分钟。滴加生物素标记的羊抗兔（： ，美国公司），孵育分钟：、 洗次，每次分钟。滴加链亲和素一过氧化物酶复合物（： ，美国公司），”，孵育分钟；、 洗次，每次分钟。用新鲜配制的在光学显微镜监视下显色分钟，自来水冲洗，终止显色：、苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，充分水洗返蓝，梯度酒精脱水，透明，加拿大胶封片。 结果观察和判定：采用盲法判定结果，在高倍镜（倍）下随机观察每张切片表皮及真皮各个视野，共个视野，以细胞染色的程度来判定。标准如下：、细胞无着色，为阴性（一）：、着色

15、细胞量少，轻度着色，呈淡黄色，为可疑阳性（）；、着色细胞量中，呈黄色，为阳性（）；、着色细胞量大，呈棕黄色，为强阳性（）。统计学分析： 结果表示为按等级分组的资料，应用统计软件，对观察结果进行秩和检验。，差异有显著意义。 结 果 在阳性对照结果呈强阳性，阴性对照结果呈阴性的情况下，得到如下结果： 、血管紧张素在正常皮肤和病理性瘢痕中的表达 血管紧张素在下常皮肤中的表达呈阴性或可疑阳性，主要分布在表皮基底层，在真皮微血管周围及汗腺腺管壁偶可见少量表达； 在增生性瘢痕内的表达呈阳性或强阳性，主要分布于表皮的棘层、 基底层及真皮的大部分区域，在表皮基底层及真皮微血管壁周围有浓集： 在疤痕疙瘩内的表达

16、类似于在增生性瘢痕中的表达。 正常皮肤中血管紧张素 的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达有显著性差异（）。而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩二者之间的表达无显著性差异（）。 、在正常皮肤和病理性瘢痕中的表达 血管紧张素受体在正常皮肤、增生性瘢痕及疤痕疙瘩内的表达分布情况类似于 。 正常皮肤中的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达有显著性差异（）。而增生性瘢痕和瘢痕疙瘩二者之间的表达无显著性差异（）。 、在正常皮肤和病理性瘢痰中的表达 血管紧张素受体在正常皮肤、增生性瘢痕及在疤痕疙瘩内的表达分布类似于 。 正常皮肤中的表达与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达无显著性差异（）；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩二者之间的表达无显著

17、性差异（）。 讨 论 一、本实验证实了血管紧张素及其受体、在人的正常皮肤中有少量分布，这与其它学者报道的结果是一致的【】。但本实验中及其受体在正常皮肤中的分布情况与其它学者的研究结果有一定差异。其它学者报道的 及其受体在整个表皮，真皮的血管壁、毛囊和皮脂腺都有表达。而本实验只发现它们在表皮基底层及皮下的汗腺腺管周有少量表达，在真皮的血管壁、毛囊和皮脂腺等处未见表达。这可能是因为使用的标本及标本处理方法的差异造成的。上述研究使用的是儿童经包皮环切术切除的包皮冰冻标本切片，而本实验使用的是儿童、成人的不同部位皮肤的石蜡包埋标本切片。不能排除部位、年龄差异和石蜡包埋的处理过程造成的抗原变化。尽管如此

18、，本实验的结果仍支持血管紧张素可能以人的皮肤为靶器官，发挥其生理功能。但皮肤中系统的具体作用及其作用机制等方面的问题尚待进一步研究。 二、本实验还证明血管紧张素及其受体在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的表达较之在正常皮肤中的表达明显增加。且在正常皮肤中，及其受体主要分布在表皮基底层及真皮的部分微血管壁，在其它部分未见分布。而在病理性瘢痕中，这两者分布的范围有所扩大，染色明显加深，不仅在表皮基底层和真皮微血管壁有分布，而且在表皮的棘层和真皮的其它大部分区域如汗腺的腺管壁等处也可见到分布。其它学者的研究表明，皮肤系统表达增加的情况不仅见于病理性瘢痕组织，“等曾就皮肤创面中系统的表达情况做了研究，结果显示从

19、伤后天开始，皮肤创面的水平有明显的增加；在同一个实验中，他们用法检测了体外培养的角质细胞在损伤后产生血管紧张素转换酶（）的情况，结果显示在伤后小时，的水平即开始增高，在伤后小时后达到峰值。结合本实验的结果，系统可能在皮肤损伤发生时即已激活，从而在皮肤的创面修复和瘢痕形成中发挥一定的作用。但令人费解的是，在本实验中，真皮成纤维细胞未见染色，可推测系统不是通过直接作用于成纤维细胞来达到其影响瘢痕形成的作用。 关于影响皮肤瘢痕形成的机制，目前尚无相关研究予以阐释，我们暂从细胞因子方面做一探讨。当前对皮肤瘢痕形成机制的研究主要集中在细胞因子上，细胞因子对瘢痕的发生发展起了重要的作用。在瘢痕形成过程中，

20、大量细胞因子激活，其中起主要作用的因子有：转化生长因子（ ，）、表皮生长因子（ ，）、血小板源性生长因子（ ，）、胰岛素样生长因子（ 一，一）、肿瘤坏死因子（ ，）、血管内皮生长因子（ ，）、 白细胞介素（，）、干扰素（）、角质形成细胞生长因子（ 一，一）。 皮肤瘢痕是一种异常纤维化的疾病，而在内脏器官的异常纤维化疾病中，细胞因子的作用同样不可忽视。有人通过研究发现，致内脏器官纤维化的过程，可通过促进转化生长因子一（）四和血小板源性生长因子（）的产生实现。 在对肺纤维化的研究中，人们发现， 可通过与结合，激活和信号通路而增加型胶原的表达【。等的研究表明，可以刺激成纤维细胞自身分泌，通过上调 的表达而促进纤维母细胞的有丝分裂及表型改变。在肾脏、心肌纤维化中 也有类似的作用。在对肝脏和心肌纤维化的多项研究中，发现可以上调及其受体的水平，从而导致纤维化的发生，但其机制尚未能阐明。 而在皮肤病理性瘢痕形成中，上述两种细胞因子的促进作用已为大量研究所证实： 、转化生长因子（ ，）据目前的研究，一是与瘢痕形成关系最密切、最具代表性的生长因子在哺乳动物中，有。、