第八章-电泳分离技术PPT演示课件

1、第八章 电泳分离技术,2,本章主要内容,一、概述 二、电泳技术原理 三、电泳技术问题和对策 四、在生物技术研究上应用的电泳技术 五、生物技术产品分离纯化上应用的电泳技术,3,一、概述 电泳技术是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。 应用最普遍的是以滤纸或凝胶作为载体，故称为纸电泳法或凝胶电泳法。,4,电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两

2、个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。,5,1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。,6,从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开

3、创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。,7,1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即电泳纯（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即Last Check,8,由80年代发展起来的新的毛细管电

4、泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。,9,电泳技术的重要性 电泳技术是一种先进的检测手段，与其它先进技术相配合，能创造出惊人的成果，可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极作用，显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视,广泛应用于各个领域。,10,在医院临床检验中，利用电泳技术分析血清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病；分析血色素组份，可以判定血细胞的正常与异常,11,一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用

5、电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药-胰岛素细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有一百多万，只此一项即可节约几亿美元。,12,电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳 动速度的差别进行分离的方法。 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技术更大规模的制备应用。 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用的难易度和成本上具优势。 在生物技术研究和产物分离纯化应用的是区带电泳。,1

6、3,电泳分类 按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦,14,区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。 是应用最广泛的电泳技术之一。,15,16,17,按电场分：常压（500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式,18,二、电泳技术原理,生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质 蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨 基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯 基）； 基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如 pH和离子强度）变化。 蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与 电场强度（E）及蛋白分子的净电

7、荷成正比 关系。,19,另一种表示方法： 由上式可知：蛋白质在电场内迁移速度与它的净电荷成正比，与它的分子的半径及溶液的黏度成反比。,20,注意：电泳使用的缓冲液的pH值、缓冲剂的类 型、浓度及样品中的盐浓度均需要仔细选择。 原因？ 低离子 溶液中，带不同电荷的蛋白分子之间会发 生相静电作用，形成大的分子团，从而影响到迁移 速度； 加大离子强度，可减少此种情况，但会提高电流， 从而产生更多的热量，温度升高会促进蛋白质分子 扩散，使电泳区带变宽，降低分辨率。,21,应用最广泛的聚丙烯酰胺电泳，具有分子筛作用。 实验证明“在分子筛范围”内蛋白质的电泳迁移速率（u）与蛋白质分子量的对数成线性关系，如

8、图。,22,三、电泳技术问题和对策,影响迁移率的有3个因素： 各组分的分子净电荷数； 分子量； 电泳系统介质的有效黏滞度。 此3因素又受控于电泳条件。,23,电泳缓冲液的pH值（决定蛋白分子所带的净电荷） 调pH值应在允许的范围内（pH4.5-9.5）尽可能使各组分分子的净电荷数的差异加大。 选择适当的缓冲系统（缓冲液种类、浓度和其他电解质浓度。）这些都会影响到蛋白质所带的净电荷及蛋白分子间的相互作用。 表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电荷差异。 适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质（蔗糖或甘油） 会影响介质的有效黏滞度。,24,问题：电泳过程中产热

9、？,后果： 蛋白质变性，分离失去意义； 温度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降低分辨率。 解决问题： W（热量）=IE I是电流；E是电压 按Ohm定律还有如下关系：W=I2/K K是 电导率,25,由上式知降低产热的方法：降低电流和降低电压。 由F=EZ知迁移率只与电压有关。 综上得：用降低电流、提高电压的方法对降热更有效。 要降低电流，要求使用的缓冲液是低离子浓度，但低离子浓度也会使电导率降低，使产热增加，同时，会增加蛋白质分子间的相互作用。故需兼顾三个方面的影响。,26,另一关系式： 应用条件是在一个绝热、不流动的系统中。 由上式可知：增加缓冲液体积、热容量或密度均可控制温度升高。但实际很

10、难应用。 有效的方法是对电泳系统进行冷却。影响冷却效果的三大因素：,27,冷却面积（热传递面积）。大面积：如采用毛细管或薄层或圆桶状电泳。矛盾：大的面积会增加电渗，影响分辨率。 电泳系统和冷却系统材质的热传递系数 热传递的推动力温差。 低温冷却最有效。同时，冷却液的流动速度也是很大影响。,28,提高电泳效果和分辨率可采以下措施： 增加缓冲系统黏度或增加介质的黏滞度均可减少扩散或对流。 减少热扩散层厚度dc， 在微重力条件下进行电泳。,29,电渗：当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电

11、压时，就会发生液体相对固体表面的移动，这种液体相对固体表面的移动就称。,30,四、在生物技术研究上应用的电泳技术,主要是对核酸和蛋白的分析、分离、鉴定、检测。 优点：其灵敏度高、重复性好、测定范围宽、结果直观等。 研究中应用最多的是：平板电泳（琼脂糖凝胶平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶平板电泳、SDS-聚丙烯酰胺电泳等） 定性分析 毛细管电泳即可定性也可定量。,31,发展： 新的电泳载体淀粉胶、纸、纤维素及其衍生物琼脂糖、聚丙烯酰胺。 显色技术氨基黑考玛斯亮兰银染法（灵敏度提高100倍）荧光标记、放射性标记。 电泳仪及相关设备和材料,32,五、生物技术产品分离纯化上应用的电泳技术,大规模电泳技术仍然处

12、于发展阶段。 （一）平板电泳（适于批式操作，微克级到毫克级） 一般平板电泳，如淀粉凝胶电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。鉴定和检测及小量样品制备。 特殊平板电泳，其使用的载体不仅仅为支持物，还起分离作用。主要是鉴定和检测，也可用于小量样品制备。,33,1、水平平板电泳 基本过程：将凝胶和交联剂混合于玻璃片上进行聚合形成凝胶平板两端加上电极液湿润的滤纸条或泡沫塑料条（与两端电极对准）将用于加样的滤纸条放在凝胶平板的适当位置加样加盖电泳。 结束后，切下一小条凝胶，显色后，按区带位置，将所需的组分切下，然后用适当缓冲液提取。,34,为了避免区带分割的盲目性，可用等电点电泳：电泳缓冲液的pH与目

13、的蛋白等电点相同，目的蛋白不迁移，保留在加样处，可多次加样。但对在等电点容易发生沉淀和凝聚的蛋白不适用。 注意：电泳前，需测定目的蛋白质在电泳缓冲液中不移动pH值，因缓冲液中离子会与蛋白质分子结合，而使等电点改变。要与等电聚焦测定的等电点区别开。 电渗：影响迁移率和分辨率。用纯化的载体可减少固定电荷、减少电渗，但不能消除。另加入与之相反电荷的材料（如DEAE-Sephadex）可中和电渗作用。,35,2、垂直平板电泳 夹心平板式（防止载体表面与缓冲液直接接触造成损失） 基本过程： 可用紫外光检测或显色法找出目的蛋白区带。后用缓冲液提取目的蛋白，一般为毫克级。 增大平板的厚度可扩大制备量。 增加

14、平板长度效果不大，且厚度增加也有限（太厚载体温度增高）。 一般来说，冷却系统很有限的情况下，凝胶厚度不超过18mm。,36,分析电泳上样是按样品中总蛋白质量计算的； 制备电泳上样是以目的蛋白为主要考虑对象。如目的蛋白在样品中含量比例很低，且目的蛋白与杂蛋白区带邻近，分离目的蛋白区带很困难，最好进行预分离；否则上样量按总蛋白量考虑。 制备电泳上样量：PAGE0.1mg/cm；IEF 1.0mg/cm；多相缓冲电泳（MBE） 10mg/cm。,37,（二）连续凝胶电泳 一种如右图 关键是洗脱池设计 此法回收目的产物浓度很低；因产热问题限制凝胶柱的直径扩大，使处理量很小。,38,另一种是在垂直PAG

15、E基础上发展起来。改进： 平板改薄的圆桶状，使设备体积变小。 电场作用，各区带依次走出凝胶、洗脱、收集 特殊结构的洗脱腔保证洗脱区带不相混合，分辨率高。 Bio-Rad开发连续洗脱电泳仪特点： 可进行PAGE，也可用于SDS-PAGE； 上样量为100ng-50mg总蛋白； 可连续收集分离的蛋白质；上样简单，仅需几分钟； 电泳分离时间4-8h 。 占总蛋白2%的不同分子量的蛋白也可纯化为单一区；可与紫外检测和部分收集器连接。,39,40,对蛋白进行预纯化后，再进行电泳分离效果更好，如藻青蛋白粗提取物经等电聚焦纯化后的SDS-PAGE效果如图。,41,（三）等电聚焦电泳 含多氨基多羧基的一系列聚

16、合物形成的两性 电解质在电场作用下能形成一个从阳极到阴 极pH逐渐增加的梯度。 关键：调配稳定的连续pH梯度。一般用氨基 酸混合物或聚氨基羧酸的缓冲液。 原理如下图 管式等电聚焦电泳和平板等电聚焦电泳。 管式结构如下图,42,43,特点： 分离性能极高，要消除分子扩散引起的分离度下降。 IEF可有效分离只有一个氨基酸排列顺序不同的两种蛋白质。 缺点： 载体两性电解质对产品产生污染； pH梯度的稳定性不高； 操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。,44,45,柱式电泳时，一般要制备密度梯度，防止对流和分离的区带混合。 密度梯度材料：蔗糖、甘油、聚乙二醇、甘露醇、右旋糖酐和聚蔗糖等。 柱内分重相（加有

17、蔗糖）和轻相（无蔗糖）。 电泳结束后，根据需要收集流出液，每管收集量应适当，过大会降低分辨率。 在放出过程中，可进行紫外检测。,46,改进：,1）旋管等电聚焦电泳 样品和两性电解质混合装入管内，并绕在圆柱上成螺旋，将管的两端放到电极槽中电泳。 电泳结束后，分割成几段，分别倾出电泳液。,47,2）水平旋转等电聚焦电泳 针对垂直柱式等电聚焦电泳存在的问题改进： 电泳柱横放，用平行多孔的聚酯膜分隔（避免对流）； 电泳柱绕中心轴旋转（克服重力和对流对聚焦区带的影响）； 用离子交换膜将电极室与电泳室隔开（防止酸、碱电极液对蛋白质的干扰）； 柱内有冷却系统。,48,49,（四）连续流动电泳 纸电泳的基础上

18、发展起来，滤纸为载体（减少组分在缓冲液中的扩散）。在垂直于电泳缓冲液方向施加电场，不同组分会在滤纸上形成不同抛物线状的轨迹。,50,51,影响电泳效果的因素：迁移率的差异、缓冲液流动速度、液流分割的级数、电场强度、滤纸载体长度等。 载体：滤纸微球状的Sephadex、Sepharose、Sephacel、Sephacry和纤维素粉等。,52,（五）无载体连续流动电泳 1、连续自由流动电泳。 实质：与连续流动动载体电泳类似，只是不用载体； 电泳槽：由两张塑料板之间形成0.5-0.8mm的间隙组成。 过程：在两张塑料板之间制成厚度为0.5-0.8mm的电泳液膜槽缓冲液自下而上平行流过电泳槽样品自下端某一点加入垂直缓冲液方向有电场带不同电荷的组分向不同电极迁移缓冲液在末端被分割、检测及分离收集。,53,电泳过程中存在问题及解决： 电渗：电泳仪材料对组分的吸附作用，易形成双电层、导致电渗的发生。一般在电泳槽内壁涂低电位的多聚物或用共价结合纤维素衍生物的方法，也可用适当增加离子强度的方法。 产热引起电泳液的对流：使电泳缓冲液流动膜厚度尽可能不超过0.5mm，加入蔗糖或甘油来提高黏度，并加强冷却能力。,54,水电解产生的气泡对电泳