分子生物学在免疫学中的常见应用

1、分子生物学在免疫学中的常 见应用 I. Introduction To Immunology II. Application of Molecular Biology in Immunology Definition : is the study of in this broader sense and of the events that occur after an organism encounters and other macromolecules The Immune System is the name of a collection of whose complex inter

2、actions form an efficient system that is usually able to protect an individual from both outside and its own internal cells. 中枢免疫器官中枢免疫器官 （Central lymphoid organ） 淋巴细胞淋巴细胞发育成熟发育成熟的场所的场所 （bone marrow）、）、 （thymus） 免疫器官免疫器官 immune organs immune organs 外周免疫器官外周免疫器官 （Peripheral lymphoid organ） 淋巴细胞淋巴细胞定居

3、和发挥功能定居和发挥功能的场所的场所 （spleen）、）、（lymphoid nodes） （MALT） 单核巨噬细胞单核巨噬细胞 （monocytes and monocytes and macrophagesmacrophages） 免疫细胞免疫细胞 immune cells immune cells 抗体抗体 （antibodyantibody） 主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体 （MHCMHC） T T 细胞受体细胞受体TCRTCR 免疫分子免疫分子 immune molecules immune molecules 12 3 4 5 免疫记忆免疫记忆 疫苗与抗感染免疫疫苗与

4、抗感染免疫 免疫记忆免疫记忆 （Immunological memoryImmunological memory） 经历了某种微生物经历了某种微生物 感染之后短时间内感染之后短时间内 一般不会再次被同一般不会再次被同 一种微生物感染。一种微生物感染。 这种现象称为免疫这种现象称为免疫 记忆。记忆。 Immunological memory makes vaccination against infectious diseases possible! 疫苗（疫苗（VACCINE） Mycobacterium tuberculosis. 脊髓灰质炎脊髓灰质炎 Polio 狂犬病狂犬病Rabies

5、天花天花Smallpox virus 白喉白喉 diphtheria Hepatitis A Hepatitis B 接种疫苗后接种疫苗后21天内的反映情况天内的反映情况 免疫记忆免疫记忆 Immunologic memory A B 白喉白喉vaccine D E Anti-白喉白喉antibody 白喉白喉Bm cell Anti-白喉白喉antibody against白喉白喉 白喉白喉 Bm cell 获得性免疫应答 免疫缺陷免疫缺陷 肿瘤肿瘤 变态反应变态反应(超敏反应超敏反应) 自身免疫性病自身免疫性病 移植免疫移植免疫 临床免疫及免疫病理临床免疫及免疫病理 Hypersensit

6、ivity Hypersensitivity 超敏反应 Immunodeficiency Immunodeficiency 免疫缺陷 Autoimmune diseasesAutoimmune diseases 自身免疫病 Cancer of the immune systemCancer of the immune system 免疫系统肿瘤 Tumor ImmunologyTumor Immunology 肿瘤免疫 I Hypersensitivity I Hypersensitivity 超敏反应 Contact allergy Contact allergy limited to th

7、e limited to the eyelids, due to eyelids, due to secondary secondary contact from hair contact from hair dye containing dye containing paraphenylenediaparaphenylenedia minemine Patients with hypersensitivity Patients with hypersensitivity vasculitis with typical skin rash.vasculitis with typical ski

8、n rash. Eczema 湿疹湿疹 An atopic eczema reaction on the back of a knee of a child allergic to rice and eggs Serum sickness 6. T T、B B 细胞联细胞联 合免疫缺陷合免疫缺陷 Severe Severe Combined Combined ImmunodefImmunodef iciencyiciency， SCIDSCID II Immunodeficiency II Immunodeficiency 免疫缺陷 HIV 感染淋巴细胞感染淋巴细胞 Immunodeficie

9、ncy Immunodeficiency 免疫缺陷 HIV budding from human lymph tissue (TEM x133,335) Immunodeficiency Immunodeficiency 免疫缺陷 Lesions on the stomach of a patient with Kaposis sarcoma Figure - Kaposis Sarcoma Kaposis sarcoma (skin). Skin showing AIDS- associated Kaposis sarcoma Immunodeficiency Immunodeficienc

10、y 免疫缺陷 Hairy leukoplakia （黏膜白斑）（黏膜白斑） of tongue in AIDS Oral thrush鹅口疮鹅口疮. Candid a and herpes simplex in AIDS Severe angular cheilitis in AIDS 口角口角 炎炎 Immunodeficiency Immunodeficiency 免疫缺陷 RA 患者手指关节实质性损伤 III Autoimmune diseasesIII Autoimmune diseases 自身免疫病 SLE 患 者 脸 部 的 蝴 蝶 斑 Autoimmune diseasesAu

11、toimmune diseases 自身免疫病 ankylosing spondylitis (B27), 强直性脊柱炎强直性脊柱炎 Destruction of pancreatic islet -cells by infiltrating T-cells in the Nonobese diabetic (NOD) mouse MOLECULAR BIOLOY Seek to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relations

12、hips contribute to the operation and control of biochemical processes. Practical in the development of new and safe products such as therapeutics, vaccines and foodstuffs, and in the diagnosis of genetic disease and in gene therapy Modern molecular biology: 一、新细胞因子的一、新细胞因子的cDNA克隆技术克隆技术 Protein FMVL.

13、 cDNA librariescDNA libraries . . . . . . . Sequencing AUG CCU AAU CCU mRNA TAC GGA TTA GGAProbe Designing Speculating . . . . . . Transfer to nitrocellulose Plating 32P Dig Colony hybridization Positive colony 差异显示技术克隆细胞因子差异显示技术克隆细胞因子 利用同一细胞在利用同一细胞在不同条件不同条件下下表达表达免疫分子的差异克免疫分子的差异克 隆新细胞因子，例如隆新细胞因子，例如T

14、细胞活化前低表达细胞因子，活化后则细胞活化前低表达细胞因子，活化后则 高表达细胞因子，利用高表达细胞因子，利用DD-PCR、RDA、SSH等技术可克隆等技术可克隆T 细胞活化后高表达的基因，其中可能含有新细胞因子细胞活化后高表达的基因，其中可能含有新细胞因子cDNA. (-) (+) Interleukin-10. Chain: l. ( 150 residues ) - 9 helices Cytokine synthesis inhibitory factor. Interleukin-10 receptor alpha chain. Chain: r Fragment. ( 205 re

15、sidues ) - 2 helices, 12 strands : extracellular domain, (-) IL-10 (+) PHA Expressing mRNA cDNA Revere transcript 第二轮杂交，第二轮杂交， 加新的变性加新的变性 driver, 退火退火 加引物加引物 + PCR扩增扩增 回收片段，克隆化回收片段，克隆化 PHA刺激的刺激的U937细胞细胞 IL-10抑制的抑制的U937细胞细胞 PHA刺激的刺激的U937细胞细胞 Tester cDNA with adaptor-1 Driver cDNA (超量超量) Tester cDNA w

16、ith adaptor-2 第一轮杂交第一轮杂交 末端补齐末端补齐 Suppression Subtractive Hybridization SSH 示意图 示意图 GTTCCCAATCTGAAGTGAAGCCGAGCTGGGCGAGAAGTAGGGGAGGGCGGTGCTCCGCCG 60 GTTCCCAATCTGAAGTGAAGCCGAGCTGGGCGAGAAGTAGGGGAGGGCGGTGCTCCGCCG 60 CGGTGGCGGTTGCTATCGCTTCGCAGAACCTACTCAGGCAGCCAGCTGAGAAGAGTTGAG 120 CGGTGGCGGTTGCTATCGCTTCG

17、CAGAACCTACTCAGGCAGCCAGCTGAGAAGAGTTGAG 120 GGAAAGTGCTGCTGCTGGGTCTGCAGACGCGATGGATAACGTGCAGCCGAAAATAAAACA 180 GGAAAGTGCTGCTGCTGGGTCTGCAGACGCGATGGATAACGTGCAGCCGAAAATAAAACA 180 M D N V Q P K I K H M D N V Q P K I K H TCGCCCCTTCTGCTTCAGTGTGAAAGGCCACGTGAAGATGCTGCGGCTGGATATTATCAA 240 TCGCCCCTTCTGCTTCAGTGTGA

18、AAGGCCACGTGAAGATGCTGCGGCTGGATATTATCAA 240 R P F C F S V K G H V K M L R L D I I N R P F C F S V K G H V K M L R L D I I N CTCACTGGTAACAACAGTATTCATGCTCATCGTATCTGTGTTGGCACTGATACCAGAAAC 300 CTCACTGGTAACAACAGTATTCATGCTCATCGTATCTGTGTTGGCACTGATACCAGAAAC 300 S L V T T V F M L I V S V L A L I P E T S L V T

19、T V F M L I V S V L A L I P E T CACAACATTGACAGTTGGTGGAGGGGTGTTTGCACTTGTGACAGCAGTATGCTGTCTTGC 360 CACAACATTGACAGTTGGTGGAGGGGTGTTTGCACTTGTGACAGCAGTATGCTGTCTTGC 360 T T L T V G G G V F A L V T A V C C L A T T L T V G G G V F A L V T A V C C L A CGACGGGGCCCTTATTTACCGGAAGCTTCTGTTCAATCCCAGCGGTCCTTACCAGAAA

20、AA 420 CGACGGGGCCCTTATTTACCGGAAGCTTCTGTTCAATCCCAGCGGTCCTTACCAGAAAAA 420 D G A L I Y R K L L F N P S G P Y Q K K D G A L I Y R K L L F N P S G P Y Q K K GCCTGTGCATGAAAAAAAAGAAGTTTTGTAATTTTATATTACTTTTTAGTTTGATACTAA 480 GCCTGTGCATGAAAAAAAAGAAGTTTTGTAATTTTATATTACTTTTTAGTTTGATACTAA 480 P V H E K K E V L

21、- P V H E K K E V L - GTATTAAACATATTTCTGTATTCTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 534 GTATTAAACATATTTCTGTATTCTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 534 CKLF1的完整的完整cDNA序列和编码的蛋白质序列序列和编码的蛋白质序列 (GenBank AF096895) CKLF1独特的功能独特的功能 广谱的体内、外趋化活性广谱的体内、外趋化活性 对造血祖对造血祖/干细胞的促增殖作用干细胞的促增殖作用 对骨骼肌细胞的促增殖分化作用对骨骼肌细胞的促增殖分化作用 新细胞因子新细

22、胞因子CKLF1（Chemokine-like factor 1) ( Biochem J 2001, 357, 127135 ) A B 小鼠骨骼肌基因注射小鼠骨骼肌基因注射10天后注射部位组织学图像（天后注射部位组织学图像（HE 132） A pcDI组；组；B pcDI-CKLF1组组 A DC B pCDI-hCKLF1 pCDI-hCKLF1 裸裸 基基 因因 注注 射射 小小 鼠鼠 肺肺 部部 病病 变变 A: 对照；对照；B: 2周；周； C：3周；周；D：4周周 CKLF1的病理作用的病理作用 CKLF1特殊的组织分布特殊的组织分布 成人组织低表达或不表达成人组织低表达或不表达

23、 胚胎组织和肿瘤组织高表达，变异体形胚胎组织和肿瘤组织高表达，变异体形 式多式多 二、基因突变二、基因突变 利用点突变技术（利用点突变技术（ ） 定向改变某（个）些氨基酸，以产生具有不同生物定向改变某（个）些氨基酸，以产生具有不同生物 学活性的新的突变体。学活性的新的突变体。 Changing one or a few nucleotides at a particular site Annealing a mutagenic primer to a template followed by complementary strand synthesis by a DNA polymerase.

24、 (PCR) IL-8 为重要的炎症介质 (急性炎症反应,类风湿性关节炎) 趋化因子介导的炎症是机体对外来刺激的一趋化因子介导的炎症是机体对外来刺激的一 种病理性免疫反应，与若干重大临床病患的产生种病理性免疫反应，与若干重大临床病患的产生 和发展密切相关和发展密切相关(炎症、自身免疫性疾病等炎症、自身免疫性疾病等)。 The role of IL-8 signaling in the tumor microenvironment. Tumor-derived IL-8 has the capacity to exert profound effects on the tumor microen

25、vironment. For example, secretion of IL-8 from cancer cells can enhance the proliferation and survival of cancer cells through autocrine signaling pathways. In addition, tumor-derived IL-8 will activate endothelial cells in the tumor vasculature to promote angiogenesis and induce a hemotactic infilt

26、ration of neutrophils into the tumor site. Although IL-8 can promote cell invasion and migration, the capacity of IL-8 to induce tumor- associated macrophages to secrete additional growth factors will further increase the rate of cell proliferation and cancer cell invasion at the tumor site. IL-8-CX

27、C家族趋化因子家族趋化因子, 最重要的中性粒细胞趋化因子，以高亲和最重要的中性粒细胞趋化因子，以高亲和 力结合受体力结合受体CXCR1/CXCR2，介导中性粒细胞引起的炎症反应。，介导中性粒细胞引起的炎症反应。 endogenic/ectogenics stimulation Mast cell neutrophil Acute inflammation monocyte IL-8 R IL-8 Chain: A ( 71 residues ) - K&S: 1 helix, 3 strands Chain: B ( 71 residues ) - K&S: 1 helix, 3 strand

28、s Chain: C ( 19 residues ) IL-8 R IL-8 N C SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCAN TEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS IL-8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819 3132 GP (3132) 目的目的: 筛选出高受体亲和力而无生物活性的突变体筛选出高受体亲和力而无生物活性的突变体 利用点突变技术（利用点突变技术（ ）定向改变某）定向改变某 （个）些氨基酸，以产生具有不同生物学活性的新的突变体。（个）些氨基酸，以产生具有不同生物学活性的新

29、的突变体。 作为作为CXCR1/CXCR2 受体拮抗剂受体拮抗剂 Changing one or a few nucleotides at a particular site Annealing a mutagenic primer to a template followed by complementary strand synthesis by a DNA polymerase. (PCR) Second position First position (5 end) Third position (3 end) U C A G U C A G U C A G U C A G U C A

30、 G U C A G Phe UUU Ser UCU Tyr UAU Cys UGU Phe UUC Ser UCC Tyr UAC Cys UGC Leu UUA Ser UCA Stop UAA Stop UGA Leu UUG Ser UCG Stop UAG Trp UGG Leu CUU Pro CCU His CAU Arg CGU Leu CUC Pro CCC His CAU Arg CGC Leu CUA Pro CCA Gln CAA Arg CGA Leu CUG Pro CCG Gln CAG Arg CGG IIe AUA Thr ACU Asn AAU Ser AG

31、U IIe AUC Thr ACC Asn AAC Ser AGC IIe AUG Thr ACA Lys AAA Arg AGA Met AUG Thr ACG Lys AAA Arg AGG Val GUU Ala GCU Asp GAU Gly GGU Val GUC Ala GCC Asp GAC Gly GGC Val GUA Ala GCA Glu GAA Gly GGA Val GUG Ala GCG Glu GAG Gly GGG SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 14 15 16 17181

32、9 3132 agt gct aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca 11K11R (精氨酸) AAGCGT CGC CGA CGG AGA AGG 赖氨酸赖氨酸 苏氨酸苏氨酸 酪氨酸酪氨酸 甘氨酸甘氨酸 脯氨酸脯氨酸 5-ctt aga tgt cag tgc ata AAG aca tac tcc aaa cct ttc cac-3 5-ctt aga tgt cag tgc ata AGG

33、aca tac tcc aaa cct ttc cac-3 cDNA About 40 bp G+C% (Tm) mutant site in the middle of the primer DNA polymerase dNTP 95 C 62 C 72 C 95 C 62 C 72 C 30 cycles DpnI DpnI 5-GmA TC-3 3-C T mAG-5 Methylase甲基化酶甲基化酶: adds a methyl group to a C () or A (dam) base within the same recognition sequences in the

34、cellular DNA. dam add a methyl group to As N6 in “GATC” sequence. Nick A-T-T-G-A-A-T-G-T-C-A-T-C-C-A-T-G 53 53 T-A-C-C-G-G-T-A-T-A-C-C-G-G-A-A-T 53 Agarose gel electrophoresis 23.1 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 0.56 MM1 2 M: marker 1.parent DNA 2.mutant DNA Transformation Plate Isolation of DNA Sequencing Exp

35、ression of mutant protein Assaying for function SAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 14 15 16 171819 3132 agt gct aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca 11K11R (精氨酸) AAGCGT CGC CGA CGG AGA AGG 赖氨酸

36、赖氨酸 苏氨酸苏氨酸 酪氨酸酪氨酸 甘氨酸甘氨酸 脯氨酸脯氨酸 5-ctt aga tgt cag tgc ata AAG aca tac tcc aaa cct ttc cac-3 5-ctt aga tgt cag tgc ata AGG aca tac tcc aaa cct ttc cac-3 111213 3132 IL-8-K11R （赖氨酸（赖氨酸/精氨酸）精氨酸） IL-8-T12S （苏氨酸（苏氨酸/丝氨酸）丝氨酸） IL-8-Y13F （酪氨酸（酪氨酸/苯丙氨酸）苯丙氨酸） IL-811R12S13F IL-8-K11R / G31P （甘氨酸（甘氨酸/脯氨酸）脯氨酸） IL-8-K11R / P32G IL-8-K11R / 31P32G IL-8-K11R / G31P: Highest binding lowest activity As a receptor antagonist Mutants- 三、基因免疫三、基因免疫 (gene immunization) DNA Vaccines The Third Vaccine Revolution Plasmid vac