研究生分生带教课件-余国庆课件

1、研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 单个核细胞（单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells-PBMCperipheral blood mononuclear cells-PBMC） 是血液中含未分叶核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞是血液中含未分叶核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生

2、分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 抑制抑制RNARNA酶活性的试剂酶活性的试剂 u焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯（DEPC)DEPC)：一种强烈的烷化剂，一种强烈的烷化剂， 能够和能够和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反酶的活性基团组氨酸的咪唑环反 应而以抑制外源应而以抑制外源RNARNA酶酶 u异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：一种强蛋白变性剂，可使包一种强蛋白变性剂，可使包 括括RNARNA酶在内的所有酶活性丧失，酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源抑制外源 性性RNARNA酶活性酶活性 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆

3、研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 1、外周血单个核细胞的分离、外周血单个核细胞的分离 1）吸取吸取2ml2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管，待用淋巴细胞分离液加入玻璃试管，待用 2）取抗凝血取抗凝血1ml1ml，用，用1ml1ml生理盐水混匀，然后生理盐水混匀，然后沿管壁沿管壁缓缓 慢慢加入加入淋巴分离液上层淋巴分离液上层 ，小心放入离心机，室温，离，小心放入离心机，室温，离 心心2000rpm，15min 3）用）用塑料吸管塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞 层于一新的离心管中，加生理盐水至管口层于一新的离心管中，加生理盐水至管口1c

4、m，混匀后，混匀后 离心，离心，2500rpm，10min 4）去上清去上清，再次加生理盐水，再次加生理盐水0.5ml，转入，转入1.5ml的的Ep管，管， 2000rpm， 2-5min 5）留细胞沉淀留细胞沉淀于于Ep管用于下一步的总管用于下一步的总RNA提取提取 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 2、单个核细胞中总、单个核细胞中总RNA的提取纯化：异硫氰酸胍的提取纯化：异硫氰酸胍-酚酚-氯氯 仿一步法仿一步法 1）在留有细胞沉淀的）在留有细胞沉淀的Ep管中一次加入管中一次加入500ul变变 性液性液Trzol、100ul氯仿氯仿-异丙醇（异丙醇（49/1），置于），置于

5、 漩涡混合器上混匀，冰浴漩涡混合器上混匀，冰浴10-15min 2）412000rpm，离心，离心10-15min，吸取上层，吸取上层 水相转入水相转入Ep 管中，加等体积的异丙醇，管中，加等体积的异丙醇，-20， 0.5h 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 3） 412000rpm，离心，离心10-15min，去上层异丙，去上层异丙 醇，加入醇，加入500ul 70%乙醇进行洗涤。乙醇进行洗涤。 412000rpm，10min，倒去，倒去70%乙醇，留沉淀乙醇，留沉淀 真空烘干真空烘干 4）用）用10ul DEPC处理水溶解处理水溶解RNA，-20保存，保存， 用于逆转录用

6、于逆转录 2 2、单个核细胞中总、单个核细胞中总RNARNA的提取纯化：异硫氰酸胍的提取纯化：异硫氰酸胍- -酚酚- -氯氯 仿一步法仿一步法 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 3、逆转录、逆转录- RT-PCR 1)反应体系： 25mM MgSO4 2ul 样品总RNA 1.25ul 随机引物 0.5ul dNTP（各10mmol/L） 0.5ul 2beast Buffer 5ul Rnasin (20-40U/ul) 0.25ul DEPC处理水 补至 10ul 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 3、逆转录、逆转录- RT-PCR 2）反应条件：）反应

7、条件： 65 1min,305min,30-65 15min,98 5min,5 5min 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 1 1、去除外源、去除外源RNaseRNase的干扰的干扰: :操作要戴口罩，仪器用具要用操作要戴口罩，仪器用具要用 0.1%DEPC0.1%DEPC水处理后灭菌；水处理后灭菌； 2 2、PBMCPBMC提取时，加入抗凝血，并且注意加入血液的方式，提取时，加入抗凝血，并且注意加入血液的方式， 离心时试管要轻拿轻放；离心时试管要轻拿轻放； 3 3、吸取单个核细胞时要注意不要吸取其它液层、吸取单个核细胞时要注意不要吸取其它液层 思考题思考题 1、总RNA提

8、取的方法？ 2、逆转录的目的和原理 ？ 实验实验步骤步骤 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 2）琼脂糖凝胶电泳：）琼脂糖凝胶电泳： agrose gel电泳是分离鉴定和纯化电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不分子的常用方法，不 同浓度的琼脂糖胶可分离同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的的DNA片段，在琼脂片段，在琼脂 糖电泳中，糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，迁移的速率不仅与其分子量

9、的对数值成反比， 即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质 粒开环粒开环DNA线性线性DNA共价闭合环状共价闭合环状DNA 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）能够嵌入能够嵌入 到到DNA分子的碱基对中形成荧分子的碱基对中形成荧 光复合物，在紫外线激发下发光复合物，在紫外线激发下发 射荧光射荧光 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、二、 实验原理实验原理 3）T4DNA连接酶连接酶: DNA连接酶是一种封闭连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于链上的缺口的酶，借助于ATP 或或 NAD+水解提供的能量，催化水解提供

10、的能量，催化DNA的的3-OH与与5的磷酸基团生成磷酸二酯的磷酸基团生成磷酸二酯 健。健。 T4DNA连接酶则连接双链连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。分子的粘性末端或平端。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、二、 实验原理实验原理 T4连接酶的连接作用连接酶的连接作用 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、二、 实验原理实验原理 3）TA克隆克隆：利用：利用Taq酶在延伸过程中会在酶在延伸过程中会在DNA的末端加的末端加A的特性，使的特性，使PCR扩扩 增产物和带增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。尾的载体在连接酶的作用下连接起来。

11、 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步骤 1、PCR 扩增目的条带（约扩增目的条带（约650bp） 1)反应体系： cDNA模板 5ul 特异性引物 （25uM） 2.0ul dNTP（各10mM） 4.0ul 2*Buffer(10) 5ul 25mM MgSO4 3ul dd H2O水 补至 50ul 阴性对照： 2）反应条件： 94 5min 94 45S 65 30S 72 30S 72 30S PCR产物于4 保存待用 30 Cycle30 Cycle 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 实验步骤 电泳鉴定：电泳鉴定： 1.配胶：取1g琼脂糖

12、放入100ml的1*TAE缓冲液 中，加热2min使溶化，冷却至600C后加入EB （5 l）至终浓度为0.5 g/ml,混匀 2.将凝胶趁热导入先前准备好的胶板中，达到 3-5mm厚。冷却至完全凝固 3.取胶放入电泳槽，将产物与6*Buffer 混匀后， 进样 4.上样端接负极，另一端接正极，以5V/cm的的 电压开始电泳，30min 5.取凝胶，观察 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步骤 3、DNA的胶回收：的胶回收： 切取琼脂糖凝胶上目的片段，称量胶的重量切取琼脂糖凝胶上目的片段，称量胶的重量 1、按、按Bi

13、nding Buffer/PCR产物产物=4：1比例加入比例加入Binding Buffer， 混匀；置于混匀；置于50-60 水浴10min，使胶彻底融化 2、把混合液转移到收集管的、把混合液转移到收集管的UNIQ-10柱中，室温放置柱中，室温放置2min， 8000rpm离心离心1min 3、倒掉收集管中的废液，加、倒掉收集管中的废液，加500ul Wash Solution 到到UNIQ-10柱柱 子中，子中，8000rpm室温离心室温离心1min 4、重复步骤、重复步骤3 5、倒掉收集管中的废液，将、倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，柱放入同一收集管中， 1200

14、0rpm离心离心15s 6、将、将UNIQ-10柱放入新的柱放入新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer或者水，室温或或者水，室温或37放置放置2min 7、12000rpm室温离心室温离心1min，离心管中的液体即为回收的，离心管中的液体即为回收的DNA片片 段。段。 8 电泳检测回收的电泳检测回收的DNA片段片段 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 实验步骤 4、与、与T载体连接载体连接 PCR产物克隆试剂盒产物克隆试剂盒 连接反应体系：连接反应体系： PMD19-T载体载体 1ul Solution 5ul 纯化

15、的纯化的PCR产物产物 4ul Final Volume 10ul 16 连接过夜连接过夜 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 四、注意事项 1、EB是强致癌物，注意操作安全； 2、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不 同的浓度； 3、DNA的纯度对酶切和连接很重要。 五、思考题 1、TA克隆的原理？ 2、T4连接酶与大肠杆菌DNA连接酶作用上有何区别 ？ 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 实验三 感受态细胞的制备、转化、培养 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 一、实验目的 1、掌握感受态细胞的制备。 2、掌握DNA转化过程

16、3、掌握蓝白斑筛选的原理 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、实验原理 1）感受态细胞转化的原理：）感受态细胞转化的原理： 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞才能大量的进行复制、 增殖和表达。受体细胞处于感受态即能从环境中吸取受体细胞处于感受态即能从环境中吸取DNA的一种生理状的一种生理状 态。在冰浴条件下，用态。在冰浴条件下，用0.1M的的CaCl2溶液悬浮活化的溶液悬浮活化的E.coli DH5a菌，使菌，使 其膜的通透性增大而成为感受态细胞，当外源重组其膜的通透性增大而成为感受态细胞，当外源重组DNA与感受态细胞混与感受态细胞混 合后在冰浴中孵育后，外源重组质

17、粒合后在冰浴中孵育后，外源重组质粒DNA就有可能进入感受态细胞内，就有可能进入感受态细胞内， 并通过自我复制实现遗传信息转移，使宿主细胞出现新性状，即感受态并通过自我复制实现遗传信息转移，使宿主细胞出现新性状，即感受态 细胞转化细胞转化 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 2）转化子蓝白斑筛选的原理）转化子蓝白斑筛选的原理: 使用的载体带有大肠杆菌的使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有短区段，含有 -半乳糖半乳糖 苷酶基因（苷酶基因（lacZ）的调控序列和）的调控序列和N端端146个氨基酸的编码个氨基酸的编码 信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏信息，这个编

18、码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏 读框，宿主细胞携带编码读框，宿主细胞携带编码 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列，虽端部分序列，虽 然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体， 形成具有活性的酶蛋白质形成具有活性的酶蛋白质- -半乳糖苷酶，这种互补现象半乳糖苷酶，这种互补现象 叫叫 互补，在生色物质互补，在生色物质X-gal和和IPTG存在下形成蓝色菌落，存在下形成蓝色菌落， 但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体 -半半 乳糖苷基因读框，不能编码乳糖苷基因读框，不能编码 -半

19、乳糖苷酶，就形成白色菌半乳糖苷酶，就形成白色菌 落。落。 二、实验原理 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步骤 1、感受态细胞的制备：、感受态细胞的制备： 1）新活化的E.coli DH5菌平板挑取一单菌落，接种于3-5ml的LB液 体培养基中，37振荡培养12小时左右，至对数生长期。 2）上述菌液以1：50量接种到100ml液体培养基中。扩大培养至 A600nm=0.7（振荡培养2小时） 3）培养液在水浴中冷却片刻后，取1.5ml菌液用冰预冷的1.5ml离心管 0-4 4000rpm离心10min收集菌体。 4）

20、去上清，用0.5ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰裕放置， 15-30分钟（20min） 5）0-4 4000rpm离心10分钟收集菌体 6）倾去上清，加入50ul预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞置于冰裕中 3-5min后待用转化，或加15-20%的甘油置于-40保存 备用。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步骤 2、重组、重组DNA的转化：的转化： 1） 上述上述Ep管中加入管中加入10ul连接反应混合物，轻轻连接反应混合物，轻轻 摇匀，摇匀， 冰裕中放置冰裕中放置30分钟。分钟。 2） 再于再于42水浴中保温水浴中保

21、温90秒，然后迅速在冰裕中冷却秒，然后迅速在冰裕中冷却 3-5分钟。分钟。 3） 加入加入250ul LB培养液，摇匀后于培养液，摇匀后于37温裕温裕30-60分钟。分钟。 4） 将上述转化反应原液涂于含氨苄青霉素、将上述转化反应原液涂于含氨苄青霉素、IPTG和和X- Gal的的LB固体培养基中。固体培养基中。 5） 待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37培培 养过夜，观察菌落。养过夜，观察菌落。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 四、注意事项 1、转化实验必须在低温中进行，温度波动严重影响转化效 率，所用的试剂均应冰浴，细菌保持在4

22、以下； 2、转化实验要做好对照，以检测感受态的细胞和重组质粒； 以已知质粒转化感受态细胞做阳性对照；以TE缓冲也转化 感受态细胞做阴性对照 五、思考题 1、重组DNA导入原核细胞有哪些方法？ 2、蓝白斑筛选的原理？ 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 实验四 重组质粒的提取、酶切鉴定 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 一、实验目的 1、掌握碱裂解法提取质粒DNA。 2、掌握质粒的酶切鉴定 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、实验原理 1）质粒DNA的分离 主要方法主要方法： 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿

23、主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性 法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶 切,连接与转化。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 2）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理： 主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大小之间的结构和大小 的差异进行分离提取的。的差异进行分离提取的。 二、实验原理 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 二、实验原理 1）碱裂解提取质粒原理：）碱裂解提取质粒原理： 基本原理基本原理： 主要利用宿主染色体主要利用宿主染色体DNA与质粒与质粒DNA之间的结构和大

24、小之间的结构和大小 的差异进行分离提取的。的差异进行分离提取的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变 性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶 解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 主要试剂： 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成 批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。 溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH

25、母液稀释)，1 SDS。 溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 2）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在分子内部的特异序列，并在 识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于 细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护 自身自

26、身DNA，限制外源，限制外源DNA。4-6碱基对，具有回纹结构碱基对，具有回纹结构 的的DNA片段；水解片段；水解DNA分子的磷酸二酯键切割方式分子的磷酸二酯键切割方式 有两种：黏性末端和平末端有两种：黏性末端和平末端 切切4碱基，平均碱基，平均256bp出现一次切出现一次切 点，切点，切6-8碱基时，每隔碱基时，每隔4-65kb出现一次切点出现一次切点 二、实验原理 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步骤三、实验步骤 1、质粒DNA小量提取步骤： 1 1收获收获 1）在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落，于37剧 烈振摇下培养过夜。 2）将1.5ml培养物倒入Ep管中，室温 8000rpm离心30s，将剩 余的培养物贮存于4。 3）吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 研究生分生带教课件研究生分生带教课件-余国庆余国庆 三、实验步