以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原—免疫学检测方法的建立

1、以磁微粒为载体的乙肝病毒 表面抗原免疫学检测方法 的建立 以磁微粒为载体的乙肝病 毒表面抗原免疫学检测 方法的建立 答辩内容答辩内容 背景介绍背景介绍 研究报告研究报告 金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表 面抗原方法的建立面抗原方法的建立 金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病 毒表面抗原方法的建立毒表面抗原方法的建立 全文总结全文总结 致谢致谢 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 2 西北大学硕士研究生论文答

2、辩西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍背景介绍 乙型肝炎病毒概述乙型肝炎病毒概述 乙肝病毒（乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒，它是引起乙型 病毒性肝炎的病原体。病毒性肝炎的病原体。 电镜下HBV 颗粒的三种形态 （摘自N Engl J Med 2004, 350: 1118-29） HBV结构模拟图 3 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍背景介绍 乙肝病毒表面抗原（乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 4 HBsAg 种类种类 大蛋白（大蛋白（L HBs） 中蛋白（中蛋白（M

3、HBs） 主蛋白（主蛋白（S HBs） 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍背景介绍 5 HBsAg的主要作用的主要作用 介导病毒进入宿主细胞介导病毒进入宿主细胞 诱导机体产生保护性抗体诱导机体产生保护性抗体 （HBsAb） 早期诊断的血清学标志早期诊断的血清学标志 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 乙肝病毒表面抗原的常用免疫学检测方法比较乙肝病毒表面抗原的常用免疫学检测方法比较 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 方

4、法方法 优点优点 缺点缺点 双抗体夹心双抗体夹心 ELISA法法 操作简便、快速，特异性操作简便、快速，特异性 高高 灵敏度不够高，容易出现灵敏度不够高，容易出现 漏检漏检 胶体金免疫胶体金免疫 层析测定法层析测定法 简便、快速，操作简单等简便、快速，操作简单等 优点，适用于急诊检验的优点，适用于急诊检验的 需要需要 灵敏度不如灵敏度不如ELISA法，须法，须 与与ELISA法并用法并用 免疫荧光法免疫荧光法 特异性强、敏感性高、速特异性强、敏感性高、速 度快度快 非特异性染色问题尚未完非特异性染色问题尚未完 全解决，技术程序也比较全解决，技术程序也比较 复杂复杂 放射免疫分放射免疫分 析法析

5、法 灵敏度高达灵敏度高达ngng甚至甚至pgpg水平，水平， 特异性强，精度高，可进特异性强，精度高，可进 行超微量分析行超微量分析 存在放射性污染，不易保存在放射性污染，不易保 存，稳定性差存，稳定性差 背景介绍背景介绍 6 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 以磁性微粒为载体的磁分离酶联免疫技术以磁性微粒为载体的磁分离酶联免疫技术（MAIA） 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 背景介绍背景介绍 磁性微粒的定义：磁性微粒磁性微粒的定义：磁性微粒(magnetic particles)，又称磁性微球，又称磁性微球(magnetic beads 或或mag

6、netic microspheres)， 是由超顺磁是由超顺磁 性纳米粒子与高分子或其它无机材料复性纳米粒子与高分子或其它无机材料复 合形成的胶态颗粒。合形成的胶态颗粒。 7 金外壳 磁内核 GoldMagTM-AS 微米金磁微粒微米金磁微粒 l 磁分离酶联免疫法磁分离酶联免疫法(magnetic affinity immunoassay, MAIA)是是20世纪世纪80 年代中期由瑞士年代中期由瑞士Serono诊断中心发明的一种免疫检测新技术诊断中心发明的一种免疫检测新技术 。 l MAIA技术具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好、无放技术具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好

7、、无放 射性污染等优点，在医学检测、食品安全检测等领域有着很好的应用射性污染等优点，在医学检测、食品安全检测等领域有着很好的应用 前景。前景。 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 化学发光免疫技术化学发光免疫技术 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 背景介绍背景介绍 l 概念：概念： 集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检 测技术。 l 特点：特点： 特异性高，敏感性高，操作简便、快速，试剂无毒，安全稳定 ，可自动化。 目前，已有许多将化学发光免疫技术应用于临床检测的研究报道 。如应用化学发光免疫分析法定量检测乙肝病毒标志物1，磁分离- 酶

8、标记-化学发光法测定促甲状腺素2等；相关的检测仪器，如： ACCESS 化学发光免疫分析仪(美国Beckman Coulter 公司) 8 1. 化学发光免疫分析定量检测乙肝病毒标志物方法学研究，标记免疫分析 与临床，2004, (11)3: 157159. 2. 磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素的应用，国外医学临床生物 化学与检验学分册，2005, (26)4: 193198. 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 以金磁微粒为载体的以金磁微粒为载体的HBsAg免疫学检测方法原理图免疫学检测方法原理图 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 背景介绍背

9、景介绍 9 + + 化学发光化学发光 金磁微粒金磁微粒Anti-HBs HBsAg Ag-Ab复合物复合物 HRP-Ab + Luminol, H2O2, PIP Ag-Ab-酶复合物酶复合物 TMB底物底物 检测检测吸光度与样品吸光度与样品 浓度成正比浓度成正比 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 研究目的及意义研究目的及意义 研究目的研究目的 以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 的免疫学检测方法，并用标准的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进血清盘对该方法进 行验证和比较，以期开发新的检测系统用于行验

10、证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg 的的 检测。检测。 背景介绍背景介绍 研究意义研究意义 HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的 复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预 后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。 10 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 . 以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙 肝病

11、毒表面抗原肝病毒表面抗原 HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被表面抗体在金磁微粒表面的包被 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择 温育时间的选择温育时间的选择 显色时间的选择显色时间的选择 精密度考察精密度考察 灵敏度考察灵敏度考察 特异性考察特异性考察 11 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 HBV表面表面抗体在金磁微粒表面的包被抗体在金磁微粒表面的包被 300400500 0.0 0.2 0.4 1 2 1 吸光度值 波长/ nm 1-包被前 2-包被后 包被前抗体

12、溶液在 280 nm处具有明显 的光吸收，包被反 应完毕后剩余溶液 在280 nm处几乎没 有光吸收出现，说 明抗乙肝病毒表面 抗原单克隆抗体几 乎全部包被在金磁 微粒表面。 HBsAb包被前后的紫外吸收曲线 12 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定 不同量的包被抗原和不同稀释度的不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果 注：注：P：阳性血清；：阳性血清；N：

13、阴性血清：阴性血清 酶标 抗体稀释度 50100200300400 1:600 P N 1.331 0.056 2.321 0.058 2.573 0.069 2.582 0.051 2.769 0.053 1:800 P N 1.14 0.05 2.168 0.058 2.308 0.054 2.533 0.052 2.362 0.053 1:1000 P N 0.848 0.05 1.839 0.05 2.074 0.05 2.175 0.05 2.208 0.05 1:2000 P N 0.561 0.05 1.113 0.05 1.330 0.05 1.472 0.05 1.506 0

14、.51 1:3000 P N 0.294 0.05 0.371 0.05 0.537 0.05 0.478 0.05 0.483 0.05 抗体包被量 （ng/孔） 当控制阳性对照当控制阳性对照OD值在值在2.0以上，阴性对照以上，阴性对照OD值在值在0.05以下（小于以下（小于0.05，以，以 0.05计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被 量为量为200ng/孔，酶标抗体孔，酶标抗体1:1000稀释作为本实验的最佳条件稀释作为本实验的最佳条件 。 13 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测

15、方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 温育时间的选择温育时间的选择 10min15min20min25min30min40min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 吸光度值 时间 /min 阳性对照 阴性对照 吸光度值随温育时间的变化 本实验中，选用温育时间为本实验中，选用温育时间为25 min，此时抗原抗体反，此时抗原抗体反 应已达平衡，且时间波动对吸光度值影响较小。应已达平衡，且时间波动对吸光度值影响较小。 14 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答

16、辩西北大学硕士研究生论文答辩 显色时间的选择显色时间的选择 5 min10 min15 min 阳性对照2.6912.860OUT 阴性对照0.0630.0870.113 不同显色时间下的检测结果 本实验中，显色时间为本实验中，显色时间为15 min时，非特异性的值较高，时，非特异性的值较高， 而显色而显色10 min和显色和显色5 min相比，阳性值和阴性值均变化不相比，阳性值和阴性值均变化不 大，说明大，说明5 min时，显色反应已达平衡。因此，选择时，显色反应已达平衡。因此，选择5 min 作为最佳的显色时间。作为最佳的显色时间。 15 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的

17、建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 临界值临界值 (Cut-off ) 的确定的确定 16 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 吸 光 度 值 OD = 0.105 阴性血样OD值分布 平均值OD值：X= 0.05 根据常用的临界值判定标准来计算该方法的临界值，即为阴性对照平根据常用的临界值判定标准来计算该方法的临界值，即为阴性对照平 均值均值2.1，阴性对照平均值，阴性对照平均值 0.05时，阴性对照值以时，阴性对照值以0.05计算，得计算，得Cut-off 值为值为0.105，我们将，我们将OD = 0.105 作为本实

18、验中判定阳性血样的临界值。作为本实验中判定阳性血样的临界值。 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 金磁微粒为载体金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性检测结果检测系统的精密性检测结果 次 数 检测结果 (扣除空白值) 阳性检测平均值 (扣除空白值) RSD(%) (批内-) 1 P2.0582.2242.1702.1112.2132.1562.91 N0.050.050.050.050.05 2 P1.8502.1322.2172.2302.2192.1306.77 N0.050.050.050.050

19、.05 3 P2.1372.1112.1902.1572.1492.1491.20 N0.050.050.050.050.05 4 P2.0912.1322.2302.1622.2042.1632.29 N0.050.050.050.050.05 5 P2.0452.0772.1712.1022.1502.1092.19 N0.050.050.050.050.05 RSD(%) (批间-)2.03 除一组检测外，方法的批内相对标准偏差（RSD）均小于5%，批间RSD仅为 2.03%。另外，用该系统对HBsAg国家参考标准品也进行了精密度测定，检测10 份样品的相对标准偏差（RSD）为8.3%，

20、这符合HBsAg国家参考标准品的精密度 要求（RSD应小于15%）。说明金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性较好。 17 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 灵敏度考察灵敏度考察 adr亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.2 ng/mL 0.5 ng/mL 1.0 ng/mL OD （扣除 空白） OUT0.050.1430.1540.145 adw亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.5 ng/mL 1.0 ng/mL 2.0 ng/mL OD （扣除 空白） OUT0.050.1100.1770.300

21、 ay亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.5 ng/mL 1.0 ng/mL 2.0 ng/mL OD （扣除 空白） OUT0.050.0600.1080.184 adr 亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.2 ng/ml 0.5 ng/ml 1.0 ng/ml OD （扣除 空白） OUT0.050.050.0910.187 adw 亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.5 ng/ml 1.0 ng/ml 2.0 ng/ml OD （扣除 空白） OUT0.050.0370.0910.204 ay 亚型 阳性对 照 阴性对 照 0.5 ng/ml 1.0 ng/ml 2.0 ng/ml OD （扣

22、除 空白） OUT0.050.0260.0740.146 金磁微粒为载体HBsAg检测系统的灵敏度检测结果 商品化的ELISA试剂盒的灵敏度检测结果 注：OUT表示所测值超出仪器的检测范围 18 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 特异性考察特异性考察 用本系统检测HBsAg国家参考品的20份阴性血清及3份强阳性 血清，结果显示，阴性符合率为100% (20/20)，阳性符合率为100% (3/3)。此外检测了203份献血者的血样，其结果与应用商品化试剂 盒的结果一致。同时检测了81份HBsAg阴性献血者

23、的血样，其阴性 符合率为100% (81/81)。 19 阳性参考品1.4392.552.708 阴性参考品 0.0640.0710.0540.0460.059 0.0820.0600.0510.0520.067 0.0550.0520.0690.0530.053 0.0540.0670.0550.0450.071 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验I I 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 小小 结结 建立了以金磁微粒为载体，检测血清中建立了以金磁微粒为载体，检测血清中HBsAg的方法。的方法。 精密性试验表明，应用该法检测阳性血清及阴性血清时

24、，方法的精密性试验表明，应用该法检测阳性血清及阴性血清时，方法的 批内及批间相对标准偏差在批内及批间相对标准偏差在1.20 7%的范围，符合临床检测要求的范围，符合临床检测要求 。 选用卫生部临床检验中心的选用卫生部临床检验中心的HBsAg国家参考品对本系统进行灵敏国家参考品对本系统进行灵敏 度分析，结果显示乙肝病毒表面抗原度分析，结果显示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最三种亚型的最 低检出浓度分别为低检出浓度分别为0.5 ng/ml，0.5 ng/ml及及 1.0 ng/ml；符合；符合HBsAg 国家参考品灵敏度检测的标准，且与目前商品化国家参考品灵敏度检测的标准，且与目前

25、商品化ELISA试剂盒的试剂盒的 检测水平相当。检测水平相当。 用该方法检测献血员血清时，与商品化试剂盒的检测结果一致用该方法检测献血员血清时，与商品化试剂盒的检测结果一致 。 金磁微粒包被抗体后，不影响其生物学活性，可成功应用于免疫金磁微粒包被抗体后，不影响其生物学活性，可成功应用于免疫 学检测。研究和开发以其为载体的血液中学检测。研究和开发以其为载体的血液中HBsAg的免疫学检测方的免疫学检测方 法对于血站筛查及临床研究具有非常重要的意义。法对于血站筛查及临床研究具有非常重要的意义。 20 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北

26、大学硕士研究生论文答辩 .金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分 析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 HBsAb在金磁微粒表面的包被在金磁微粒表面的包被 最佳化学发光检测条件的确定最佳化学发光检测条件的确定 标准曲线的制作标准曲线的制作 精密度考察精密度考察 21 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 HBsAb在金磁微粒表面的包被在金磁微粒表面的包被 300400500 0.0 0.2 0.4 1 2 1 吸光度值 波长/ nm 1-包被前 2-包

27、被后 HBsAb包被前后的紫外吸收曲线 22 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 化学发光检测缓冲体系的选择化学发光检测缓冲体系的选择 23 缓冲体系对化学发光信号缓冲体系对化学发光信号 有很大的的影响。有很大的的影响。 本实验中选择本实验中选择CBS体系为化体系为化 学发光检测的最佳缓冲体系。学发光检测的最佳缓冲体系。 同时选择同时选择CBS缓冲体系的最缓冲体系的最 佳浓度为佳浓度为0.1 mol/L。 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大

28、学硕士研究生论文答辩 体系体系pH值对化学发光信号的影响值对化学发光信号的影响 pH在在8.0 9.5范围内，发光信号随范围内，发光信号随pH升高而增强，在升高而增强，在pH 9.5时时 发光信号最大；发光信号最大；pH值大于值大于9.5时，发光信号随着时，发光信号随着pH值的增大而逐渐值的增大而逐渐 降低，所以本实验选择降低，所以本实验选择pH 9.5，0.1 mol/L CBS缓冲液为缓冲介质。缓冲液为缓冲介质。 24 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 发光试剂的浓度的选择发光试剂的浓度的选择 实验中

29、对鲁米诺、过氧化氢及对碘苯酚（PIP）的浓 度对HBsAg测定的化学发光信号影响做了考察。结果表 明，当鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓 度分别为510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L时 ，化学发光信号值最大。因此，本实验选择鲁米诺溶液 、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L。 25 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 检测体系的最优条件检测体系的最优条件 HBsAb包被量：200ng/孔；酶

30、标抗体为1：1000稀释。 温育时间：25分钟。 化学发光检测的缓冲体系：pH 9.5，0.1 mol/L CBS缓 冲液。 鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分 别510-4 mol/L, 110-3 mol/L和110-3 mol/L。 26 以磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原 免疫学检测方法的建立 实验实验II 西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 HBsAg检测标准曲线的制作检测标准曲线的制作 磁分离化学发光免疫法检测磁分离化学发光免疫法检测HBsAg的标准曲线的标准曲线 HBsAg (10-12 g/mL) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 020040060080010001200 相对光子数 Y = 9.329 X + 891.7 R2=0.996 27 检测检测11份份HBsAg阴性阴性 血清