Cre_Loxp系统的应用及进展.

1、第 36卷第 2期广州医 学院 学报 Vol.36No.2 2008年4月 ACADEMIC JOURNAL OF GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE April.2008 作者简介 :任荣荣 (1981.11-, 女 , 硕士。 研究方向：电压门控性钠离子通道P亚基在神经病理性疼痛中的 作用。 *通讯作者：Tel :021? 65790000, E? mail : 综述- Cre/Loxp 系统的应用及进展 任荣荣 综述 王英伟 审校 (上海交通大学医学院附属新华医院麻醉科 , 上海 200092 关键词Cre重组酶;Loxp位点；转基因技术；Cre/Loxp系统 中图分类号

2、 Q812 文献标识码 :A 文章编号 :1008? 1836(2008 02? 0078? 03 随着分子生物学的迅猛发展 , 转基因技术发挥 着越来越重要的作用 , 已经渗透 到人类生活的各个 领域。所谓转基因技术就是将人工分离和修饰过的 基因导入到 生物体基因组中 , 由于导入基因的表达 从而引起生物体性状可遗传的修饰。转基因 技术推 动了从分子水平了解生命现象、 探讨生命本质、 研究 疾病发生机理等方面 的发展。国内外在动物转基因 技术方面均已开展了卓有成效的工作。其中小鼠转 基因研究方面成就最大、发展最为迅速、应用最为广泛的就是应用Cre/Loxp系 统对小鼠进行基因的敲 除、 激活

3、、 倒转和易位等。 1Cre/Loxp 系统的概述 Cre/Loxp 重组系统策略是进行基因组定点突变 的新途径 1,2。该系统在 80年 代被引入后 , 已被成功 的应用于酵母菌、 植物、 哺乳动物细胞培养及小鼠身 上。 Cre/Loxp 重组系统包括 Cre 重组酶和 Loxp 位点 两个部分 , Cre 重组酶由大肠杆菌 噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成,它不仅具有催化活 性,而且跟限 制酶相似, 识别特异的 DNA 序列, 如: Loxp 位点, 引起重组。 Loxp 位点是 Cre 重组酶作用的特异性重组位 点 , 由 34bp 组成 , 即 :ATAACTTCGTA

4、TAGCATA ? CATTATACGAAGTTAT , 两个 13bp 的反向重复 顺序和 8bp 的间隔区域构成。 Cre 重组酶有 70%的重组效率, 不借助任何辅助因 子, 作用于多种结构的 DNA 底物, 如线形、环状, 甚至超螺旋 (被 Cre 重组酶解螺 旋成为线形结构 1,3。 Cre 重组酶通过与 DNA 上 Loxp 位点的结合, 发挥其重组作 用1。2Cre/Loxp系统的应用 Cre/Loxp重组系统可在哺乳类细胞和转基因鼠中因Lox p位点设计的不同而产 生特异性重组 4? 6。其应用主要包括基因失活或敲除、 基因激活、基因颠换、 基因易位, 还可以利用此系统进行载体

5、的构建。 2.1内、外源基因失活或敲除 相对传统的基因突变技术,Cre/Loxp系统借助Cre重组酶表达的特异性,条件性 敲除基因 , 大大降低了、鼠的死亡率。具体分三部分 : (1 在胚胎干细胞 (embryonic stem cell , ES cell 中通过置换型载体进行同源重组 , 向基因组靶位点引入选择标记基因 , 并在其两侧引入两个同向排列 的 Loxp 位点。 两条同源染色体都带有 Loxp 位点且引入的 Loxp 位点不能干扰靶基因的转录。将 该ES细胞打入假孕母鼠中,发育成“ floxec小鼠”。但要 保证“ floxec小鼠”表型 要跟野生型小鼠一致。(2利用原核注射的方

6、法获得转基因“ Cre、鼠”。此转基因 、鼠在特定的启动子下表达 Cre 重组酶, 其 Cre 酶的重组效率可以用其他的工具鼠 (如Rosa26检测。 (3“ C小鼠”跟“ floxed、鼠”交配,Cre重组酶会 切掉Loxp位点之间的靶基 因和 1个 Loxp 位点, 从而达到靶基因的失活或敲除 4? 7。 2006年, Berton 等 8 利用上述方法把大鼠脑源性神经营养因子 (brain ? derived neurotrophic fac ? tor,BDNF 的局部表达降低 , 产生类似长期服用抗抑郁药的抗抑郁效果 , 从而证明了 BDNF 参与到神经环路和行为可塑性的过程中。 2

7、.2基因激活 利用Cre/Loxp系统不仅可对基因进行敲除,还可对基因进行特定激活,了解基 因的正向效应。在两个同向 Loxp 位点之间加入终止信号 , Loxp 位点后加入靶基因 , 与 Cre 小鼠交配后 , Cre 重组酶切除终 78 第 2期任荣荣, 等. Cre/Loxp 系统的应用及进展 止信号及 1个 Loxp 位点, 其 Loxp 位点后面的靶基因便被“激活”表达。 Hnasko 等 9选用多巴胺缺陷的小鼠, 在表达内源性酪氨酸羟化酶基因的前面加了 1个 Loxp ? pgk ? neo ? Loxp , (pgk 为酪氨酸羟化酶的终止信号, neo 为筛选 标记 , 正常情况

8、下 , 小鼠表达 pgk , 后面的酪氨酸羟化酶不表达 ; 在小鼠尾状核注入 Cre 重组酶的情况下 , Cre 重组酶切掉终止信号 pgk 和 1个 Loxp 位点, 酪氨酸羟化酶 便表达, 尾状核部位生成多巴胺 , 从而研究神经递质多巴胺在这个 部位的功能。 2.3基因插入 采用同源重组技术 , 在基因组上人工构建两个 Loxp 位点, 借助构建的两个 Loxp 位点, 把两端带有 Loxp 位点的外源基因重组到基因组上 , 此种重组是双向的, 既可 以把外源基因重组到小鼠基因组内 , 也可把小鼠基因组内源基因重组出来 , 这是定 点整合的重要手段之一。 2.4基因倒转 在同一染色体上构建

9、两个相反的 Loxp 位点, 在 Cre 重组酶的作用下 , Loxp 位点 之间的靶基因反方向倒转。 2.5基因易位 在不同染色体上分别构建 1个 Loxp 位点, 在 Cre 重组酶的作用下 , Loxp 位点后 面的基因发生重组,不同染色体上大片段基因互相交换,染色体易位。Testa等10 利用此原理进行了如下操作 :首先, 利用同源重组的方法在 13号染色体 DEK 基因 的内含子加入 Loxp 位点及筛选标记 hygro （潮霉素 ; 其次, 利用同样的方法在二号 染色体 CAN 基因的内含子加入筛选标记 neo （新霉素及 Loxp 位点; 最后, 在 Cre 重 组酶的作用下,

10、DEK 基因片段与 CAN 基因片段交换, 产生 DEK ? CAN 融合基因, 实现基因易位。3Cre/loxp系统的新进展 80年代Cre/Loxp系统的时间与空间的控制依赖 于Cre的启动子,现在发展为 依赖于受体与配体的结合来实现其时间、 空间的控制。 目前, 可从两个水平进行调控 , 即:转录水平和翻译后水平。转录水平的调控以 四环素 （抑制控制系统为例 1 1 :在没有四环素的情况下 , 转录激活蛋白与转录激 活蛋白基因相结合 , 激活后面 Cre 重组酶的表达; 在四环素存在的情况下 , 四环素与 转录激活蛋白相结合 , 使其不能结合转录激活蛋白基因 , 从 而达到了抑制的目的。

11、翻译后水平以雌激素系统为 例:2007年, Bradley 等 12 在scl基因的启动子或加 强子？ 0.9E3后面加上1个Cre ? er （er表达雌激素他莫 西酚的受体的基因, Cre 基因就可以按照 scl 基因的表达方式表达, 从而得到“ Cre ? er 工具小鼠”。在正常情况下“ Cre? er 工具小鼠”不表达 Cre 重组酶, 使用雌 激素他莫昔酚 （tamoxifen 诱导才能表达 Cre 重组酶。这只 scl ? Cre ? er 小鼠可以 与其他的“ Loxp小鼠”进行交配,交配的后代可以在特定时间注入雌激素 tamoxifen , 与雌激素受体结合后 , 表达 Cr

12、e 酶, 就可以对后代小鼠的 Loxp 位点 进行重组。为了避免体内 雌激素的干扰 , 可对雌激素受体基因的配体结合区 做一定 程度的改变, 使其只能和某些雌激素衍生物 相结合, 确保条件重组的特异性。 现在不仅用Cre/Loxp系统进行基因的失活或敲 除、基因激活、基因颠换、 基因易位, 还可以用其构建高效表达的载体。 2007年, 王文棋等 13利用此系统构 建了 1个高效表达绿色荧光蛋白（Green fluoresce nt protein , GFP的载体。在 Cre 酶的作用下, 把 gfp 基因先从基因供体 pTLG 上切下来, 然后通过重组把 gfp 整 合到基因受体 pET ?

13、 Loxp 受体上, 完 成 gfp 基因高效表达载体 pET ? gfp 的构建, 从而使繁 琐的传统载体构建变为简单的酶促反应 , 极大地简 化了载体构建步骤 , 免 去为构建载体选择酶切位点 的繁琐 , 为 Cre 酶在基因克隆和亚克隆中的应用提 供了 很好的研究基础。 利用Cre/Loxp系统进行遗传操作具有显著的优势,许多学者对此已进行了大 量的研究工作 , 此系统 被广泛应用于小鼠的转基因研究中。 Cre/Loxp 系统 短小精 悍、 Cre 酶作用专一 , 且不影响基因的正常表 达与调控, 该系统的应用为转基因技 术开辟出一条 崭新的道路。 参考文献 1Trinh KR , Mo

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