考马斯亮蓝法测定(实验报告)

1、考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量 吴凡郭梦雨 摘要：本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光 度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pHfi、外源添加物对果 肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法， 以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可 行的方法。结果表明：外源添加PV嗣EDT/以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影 响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/LpH9.0Tris-HCI提取缓冲液（内含 1mmol/LEDT和1%PVP）此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.9

2、3%。 关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物 1实验部分 1.1实验原理 果蔬可溶性蛋白质含量（solubleproteincontent）是一个重要的生理生化指 标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶 的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、 成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm当它与 蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在 595nm在一定的蛋白质浓度范围内，蛋 白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定 59

3、5nn处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应 非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000 卩g/mL，最小可测2.5卩g/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添 加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。 1.2实验准备 1.2.1实验材料 新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-

4、250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨 基甲烷（Tris）、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮（PVP）、NaCl、 MgCl2、抗坏血酸、半胱氨酸、B -巯基乙醇。 1.2.2仪器与设备 容量瓶（25mL10个、100mL1个、500mL1个、棕色瓶1个、分析天平、胶头 滴管、烧杯（50mL2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL1个、25mL1个）、研钵、 移液枪(1000丄) UV-1800型紫外-可见光分光光度计日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。 1.2.3试剂配制 123.1标准蛋白质溶液(100卩g/m牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白25mg，加水 溶解并定容至100m

5、L,吸取上述溶液40mL用蒸馏水稀释至100mL 123.2考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250,溶于25mL90%乙醇中，力卩 入50mL85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中； 1.2.3.3提取液：pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCI 缓冲液(100mmol/L); 1.2.3.4梯度浓度 Tris-HCl 缓冲液(pH9.0): 10、30、50、80、100mmol/L; 1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮 (PVP)(

6、1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、 半胱氨酸(2mmol/L)、提取缓冲液pH值为9.0时提取效率最高，比水提组和 提取组pH值为7.2分别高125.27%、85.61%。查阅文献得，整体上Tris-HCI缓冲溶 液提取效率高于磷酸盐（PBS）缓冲溶液苹果果肉组织可溶性蛋白质提取的适宜 缓冲溶液为pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液。 2.2.2不同缓冲液浓度对可溶性蛋白质提取效果的影响 表四不同浓度Tris-HCl对可溶性蛋白质提取效果的影响 蛋白含童% 溶液mmol/L 0 10 30 50 80 100

7、吸光度A 0.129 0.149 0.166 0.196 0.238 0.264 蛋白含量卩g 19.19 22.92 26.09 31.68 39.50 47.33 蛋白含量% 15.35 18.34 20.87 25.34 31.60 37.86 （其中，1-6分别表示浓度为 0、10、30、50、80、100mmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液） 常用可溶性蛋白质提取缓冲液浓度为0.020.05mol/L缓冲体系，实验过程 中，选择 0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L 的 pH 为9.0的 Tris-HCl 缓冲溶液进行实 验，结果如图所示。由图可知

8、，低浓度pH为9.0的Tris-HCl缓冲条件即可明显提高 可溶性蛋白的提取效率（如10mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量比对照水提组 高19.48%）。且随着Tris-HCl缓冲液浓度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、 50、80、100mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量分别比对照高 35.96%、65.08%、 105.86%、146.64%。其中，100mmol/L缓冲液提取效果最佳，其可溶性蛋白有效 提取量比80mmol/L缓冲液仍高出19.81%。 2.2.3外源添加物对可溶性蛋白提取效果的影响 以上述实验确定的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为基础

9、提取液， 添加蛋白酶保护剂和抑制剂，进一步探讨外源添加这些物质对真实测定果蔬组织 中可溶性蛋白质的含量的影响。 分别选取抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、禺巯基乙醇、NaCI、MgCl2以及这些试剂的不同组合进行实验，以不添加任何添加 物的100mmol/L, pH为9.0的Tris-HCI缓冲溶液为对照，结果如下图所示。 表五不同外源添加物对可溶性蛋白质提取效果的影响 （其中，A-J分别代表抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA PVP 3 -巯基乙醇、NaCI、MgC2、PVP 外源添加物 抗坏 血酸 半胱 氨酸 EDTA PVP 3 -巯 基乙醇 NaCl MgCl2 PVP+3 -巯基乙 醇

10、 PVP + EDTA EDTA + PVP+3 - 巯基乙醇 无 吸光度A 0.215 0.243 0.326 0.354 0.173 0.163 0.180 0.191 0.383 0.201 0.261 蛋白含量卩g 35.22 40.43 55.90 61.12 27.39 25.52 28.69 30.74 66.52 32.61 43.44 蛋白含量% 28.18 32.34 44.72 48.90 21.91 20.42 22.95 24.59 53.21 26.09 34.75 + 3 -巯基乙醇、PV却EDTA EDTA PV卉3 -巯基乙醇） 单独添加2mmol/L半胱氨酸

11、对可溶性蛋白提取效果无明显影响；单独添加 2mmol/L抗坏血酸、0.15mmol/LNaCI、2% 3 巯基乙醇和 0.15mmol/LMgC 12对该浓 度和pH值的缓冲液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，这 4种物质处理后，可 溶性蛋白提取量分别比对照组低 23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。从3 -巯基 乙醇和PVP及EDTA的复合处理结果也可看出其对果实可溶性蛋白提取的抑制作 用，PVF+3 -巯基乙醇处理组可溶性蛋白测定量比 PV处理组低，PVP+ EDTA + 3巯基乙醇处理组可溶性蛋白含量比 PVP+ EDTA组低；单独添加PVP和EDTA均 有助于提高果实

12、可溶性蛋白的提取率，PVP效果（比对照高40.71%）好于EDTA（比 对照组高28.69%）。而PVP和 EDTA复合处理效果比单独处理效果更佳， 其有效可 溶性蛋白提取量比对照高53.12%。 2.3苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 表六苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 次数 项目 吸光度 蛋白含量 卩g 蛋白含量% 平均值 1 0.260 43.60 34.88 34.93 2 0.263 44.16 35.331 3 0.258 43.23 34.58 研 明, 上述 究结果表 以考马斯 亮蓝G-250染色法测定组织微量蛋白含量时，果实可溶性蛋白提取受提取液pH值、 缓冲盐种类、缓冲盐浓度

13、、外源添加物 PV嗣EDT/等因素影响。实验最终确定的 适用于苹果果实可溶性蛋白含量测定的提取条件为，0.1mol/L,pH为9.0的Tris-HCl 提取缓冲液（内含1mol/LEDTA和1%PVP），1:5料液比，此条件下，果实可溶性蛋 白的有效测定含量为34.93%（ mg/g） 3其他 3.1实验流程图 果蔬组鏡可落性蛋白质的提取 称取1當苹果肉 最佳 3冲 涪液 和PH 的确 A 鼠隹 提取 缓冲 液浓 度的 确定 适 宜外 加物 的确 定 确定虽住醍取条件 藍马晒亮蓝3-750濬帝全叢怪扫描 测定苹舉過爼可谐性蛋白含屋 绘制标准曲缆 3.2考马斯亮蓝法的优点 3.2.1灵敏度高，据

14、估计比LowrR法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg这 是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的 消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比LowrR法要大的多。 322测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5分钟左 右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1 小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用 像LowrR法那样费时和严格地控制时间。 3.2.3干扰物质少。如干扰LowrR法的K、Na Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 3

15、.3考马斯亮蓝法的缺点 3.3.1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 3.3.3仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Trit on R-100、 十二烷基硫酸钠(SDS和0.1N的NaOH (如同0.1N的酸干扰LowarR法一样)。 3.3.3标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标 准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 3.4染料考马斯亮蓝有G250和 R250两种形式 在颜色索引(ColourlndeR )中

16、给出了不同的编号(42655和42660)。亮蓝 G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两 种染料均能对固定的蛋白有效地进行染色，使用浓度为溶于甲醇：冰醋酸：水 (50:10:40 )的0.05%溶液。但考马斯亮蓝R250尤其适用于SDS-PAG电泳微量 蛋白质的染色，所以本次实验选择了考马斯亮蓝G25Q 3.5测定时间 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡； 其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测 定结果偏低。如果要求严格，最好在试剂加入后的 5-20min内测定光吸收，因为 这段时间内颜色

17、是最稳定的。 3.6比色皿的清洗 染料易吸附在比色杯上而造成误差， 每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗 涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。 3.7混合方式 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡难于消除 3.8实验中选用BSA乍为蛋白质含量标准曲线的优点 3.8.1易于获得。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38g/100ml), 含量高，易于获得，而且提取纯化也容易。是来源和纯化都成本很低的蛋白质。 3.8.2氨基酸含量较全。含有16种氨基酸，虽然不全，但也差不多了。由581个氨 基酸残基组成（可能不同来源的BSAf肖有不同），其中35个半胱氨酸组成17个二硫 键，在肽链的第34位有一自由巯基。不同的测定方法的原理都不同，但是氨基酸 残基多的蛋白质可以对多种测定方法起反应。 3.8.3分子量适中。溶菌酶属于最小的