DNA的粗提取与鉴定

1、DNA的粗提取与鉴定课题1 DNA的粗提取与鉴定相成区望亭中学 215155周琴）摘要：DNA和蛋白质技术，包括 DNA的提取、蛋白质的提取、 DNA片段的扩增等，是 开展分子生物学研究的基本技术。本专题将从基础入手，学习DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术，不仅能够帮助学生初步了解分子生物学的基本实 验方法，而且能够巩固必修课中学习的有关 DNA和蛋白质的理论知识。本专题的3个课题相对独立，没有严格的先后顺序。课题 1的操作难度不高，学生 比较容易获得结果。课题 2的操作难度也不高，但 PCR技术的原理是难点，学生要充 分利用教材的图文资料， 并且在教师的引导下进行实验操

2、作。 课题3的操作难度比较大， 所以学生一定要在教师的精心指导下完成操作。关键词：DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯【导学诱思】1 .提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路 是。对于DNA的粗提 取而言，就是要利用 、等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分。1.1 DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同，利用这一特点，选 择适当的盐浓度就能使 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相 反，以达到分离目的。图5 1是DNA在NaCI溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考： 1.1.1在什么浓度下，DNA的溶解度最 小？ DNA在NaCI溶液中的溶解度是

3、如 何变化的？1.1.2如何通过控制NaCI溶液的浓度 使DNA在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA 不溶于 溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于 酒精。利用这一原理，可以将 DNA与 蛋白质进一步的分离1.2 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60 80oC 的高温，而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解但对DNA没有影响。1.3DNA的鉴定在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2 实验设计2.1实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的可能性更大。在下 面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼

4、卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、 鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋 葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠 杆菌思考：哺乳动物的红细胞的特点？2.2破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞 为例，在鸡血细胞液中加入一定量 的，同时用搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植 物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的 DNA时，在切 碎的洋葱中加入一定的 和，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。思考：2.2.1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?222加入洗涤剂和食盐的作用 分别是什么？2.2.3如果研磨不充分，会对实验 结果产生怎样的影响？2.2.4此步骤获得的滤

5、液中可能 含有哪些细胞成分？2.3去除滤液中的杂质阅读课本的三个方案，思考：2.3.1为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？2.3.2方案二与方案三的原理有 什么不同？2.4 DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体 积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的 量浓度为的NaCI溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中， 用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后， 向两支试管中各加入4ml的。混合均匀后，将试管 置于中加热 5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变 化，看看溶解有DN

6、A的溶液是否 变。3. 操作提示以血液为实验材料时，每100ml血 液中需要加入 3g_，防止。加入洗涤剂后，动作 要、.，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操 作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作 要，以免导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。4. 结果分析与评价【疑难点拨】1. DNA的溶解度与NaCI溶液浓度的 关系：当NaCI溶液浓度低于 0.14mol/L 时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低； 当NaCI溶液浓度高于0.14moI/L时，随 浓度升高，DNA的溶解度升高。2. 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血 中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，

7、要在新鲜的鸡 血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血 液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中 Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物， 血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不 会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所 以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清 液 血浆。3. 提取DNA的第一步是材料的选取， 其目的是一定要选取DNA含量较高的 生物材料，否则会由于实验过程中或多 或少的损失而造成检测的困难；第二步 是DNA的释放和溶解，这一步是实验 成功与否的关键，要尽可能使细胞内的 DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化， 即根据DNA的溶解特性、对酶及高温 的耐受性的不同等特性，最

8、大限度地将 DNA与杂质分开；最后一步是对 DNA 进行鉴定，这是对整个实验的结果的检 测。4. 在DNA的析出的步骤中用到玻 璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加 剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀5. 盛放鸡血细胞液的容器，最好是 塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞 内DNA的含量本来就比较少，再被玻 璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用 塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取 过程的DNA的损失。【典例解析】本实验中有三次过滤：（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞 液；（2）滤含粘稠物的 0.14mol/LNa

9、CI 溶液；（3）过滤溶解有DNA 的 2moI/LNaCI溶液。以上三次过滤分别为 了获得（）A .含核物质的滤液、纱布上的粘稠 物、含DNA的滤液B. 含核物质的滤液、滤液中DNA粘 稠物、含DNA的滤液C. 含核物质的滤液、滤液中DNA粘 稠物、纱布上的DNAD. 含较纯的DNA滤液、纱布上的粘 稠物、含DNA的滤液【解析】用蒸馏水稀释鸡血细胞液， 使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出 核物质，此时过滤只能得到含 DNA和 其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必 须经过实验中其他步骤得相继处理，方 能得到较纯的DNA 。 DNA 在 0.13mol/LNaCI溶液中溶解度最低，成 丝状粘稠物，

10、可经过滤留在纱布上。答 案：A课堂演练 一、选择题1在研究DNA的基因样本前，采集来 的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有 机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理 血 样 的 目 的 是( )A .除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C 除去血细胞表面的蛋白质D .除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯2.与析出DNA粘稠物有关的叙述，不 正确的是( )A. 操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B. 在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌， 以保证DNA分子完整C. 加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白 质的溶解度，两者均可析出D. 当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCI的浓度相当于0.1

11、4mol/L3.洗涤剂能够瓦解(），但对DNA没有影响。()A .细胞壁B .细胞膜C.细胞核D.细胞质4.在沸水浴的条件下，DNA 遇()会被 染成蓝色。()A.斐林试剂B. 苏丹皿染 液C .双缩脲试剂D .二苯胺5在DNA提取过程中，最好使用塑料 试管和烧杯，目的是 ( )A.不易破碎 B.减少提取过程中 DNA的损失 C .增加 DNA的含量 D .容易洗刷6. 下列操作中，对DNA的提取量影响 最小的是( )A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂， 放出DNA等核物质B 搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方 向轻缓搅拌C. 在析出DNA粘稠物”寸，要缓缓 加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D. 在

12、用酒精沉淀DNA时，要使用冷 酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充 分搅拌7. DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（），静置23min，溶液中会出现白色丝状物。()A09% 的NaCIB.0.14mol/L 的 NaCI 溶液C .质量分数 15%的HCID.体积分数为95%的酒精8以血液为实验材料时，需要向血液中 加入（），防止血液凝固。（ ）A 醋酸钠B 龙胆紫C 柠檬酸钠D 醋酸洋红9.在向溶解 DNA的NaCl溶液中，不 断加入蒸馏水的目的是（ ）A .加快溶解DNA 的速度 B.加快溶解杂质的速度C.减少DNA的溶解度，加快 DNA 析出D.减

13、小杂质的溶解度，加快杂质的析出10 .去除滤液中的杂质时，直接在滤液 中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白质。A .胃蛋白酶B.胰蛋白酶C .木瓜蛋白酶D 肠肽酶1 提取鸡血中DNA时，要除去血液中 的上清液，这是因为什么？2 填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。提取鸡血细胞中核物质溶解核内DNA : 析出2mol/LNaCI溶液中的DNA _DNA粘稠物的再溶解提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物(6)DNA的鉴定3.关于DNA粗提取的实验材料的选择， 也经过了多次实验效果的比较，最终选 择鸡血做实验材料的原因是什么？请回 答下列问题：鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富 的。实验前由老师制备血细胞液供同学们 做实验材料，而不用鸡全血，主要原因 是生活在牧区的人们，采集牛、羊和马 血比较方便，若他们按实验要求完成实因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为。若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加程序，使组织细胞更易分离。参考答案、1、D 2、C3、B4、 D 5、 B6、 B 7、