专06 实验方法的选择与检测系统的评价验证[课件材料]

1、第六章第六章 实验方法的选择与实验方法的选择与 检测系统的评价验证检测系统的评价验证 1优选专业 n教学目的和要求：教学目的和要求： 1 1、掌握掌握实验方法的分级；实验方法选择的目的、原则；检测实验方法的分级；实验方法选择的目的、原则；检测 系统性能评价的内容；方法评价实验尤其是回收实验和干扰实系统性能评价的内容；方法评价实验尤其是回收实验和干扰实 验的原理和操作。验的原理和操作。 2 2、熟悉熟悉实验方法选择的步骤；试剂盒的使用。实验方法选择的步骤；试剂盒的使用。 3 3、了解了解试剂盒的类型和选购试剂盒的类型和选购 2优选专业 第一节第一节 实验方法的选择实验方法的选择 选择选择准确可靠

2、准确可靠的实验方法的实验方法 为为临床临床提供提供准确可靠准确可靠的信息的信息 临床生化检验分析临床生化检验分析 保保 证证 3优选专业 一、实验方法的分级一、实验方法的分级 分级依据分级依据：国际临床化学协会（：国际临床化学协会（IFCCIFCC） 根据分析方法的根据分析方法的准确性与精密度准确性与精密度的不同。的不同。 v常规方法常规方法 v参考方法参考方法 v决定性方法决定性方法 分为三级：分为三级： 4优选专业 （一）常规方法（一）常规方法（routine method ） p定义：定义： 应具有应具有足够足够的精密度、准确度和特异度，有的精密度、准确度和特异度，有适当适当的分析范围，

3、的分析范围，经济实用经济实用， 其性能指标符合临床或其它目的的需要。其性能指标符合临床或其它目的的需要。 p主要方法：主要方法： 溴甲酚绿法、双缩脲法、溴甲酚绿法、双缩脲法、J-GJ-G法等。法等。 p应用：应用： 临床临床常规检验常规检验使用，使用，常规方法在常规方法在 作出评定以后，经有关学术组织认可，作出评定以后，经有关学术组织认可， 可以作为可以作为推荐方法（推荐方法（recommended recommended methodmethod ） 。 偏差已知方法偏差已知方法偏离未知方法偏离未知方法 5优选专业 （二）参考方法（二）参考方法reference method p定义：定义：

4、 是指是指准确度与精密度已经被充分证实准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权，且经公认的权 威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁 布的方法。这类方法布的方法。这类方法干扰因素少干扰因素少，系统误差很小，有适当的系统误差很小，有适当的 灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定，重复测定 中的中的随机误差可以忽略不计随机误差可以忽略不计。 p主要方法：主要方法： 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等、火焰光度法、免疫化学法，离子交换

5、层析法等 6优选专业 p应用：应用： 能在能在条件优越条件优越的实验室作的实验室作常规分析常规分析，主要用于鉴定主要用于鉴定 常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以 被接受；用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于被接受；用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于 商品试剂盒的质量评价。商品试剂盒的质量评价。 7优选专业 （三）决定性方法（三）决定性方法definitive methoddefinitive method p定义定义： 是指是指准确度最高，系统误差最小准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，经过详细的研究，没有没有 发现

6、产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，其测定结，其测定结 果与真值最为接近。果与真值最为接近。 p主要方法：主要方法： 重量分析法重量分析法、中子活化法、同位素稀释、中子活化法、同位素稀释- -质谱分析法（质谱分析法（ID-MSID-MS） 8优选专业 p应用：应用： 由于由于技术要求太高，费用昂贵技术要求太高，费用昂贵，这类方法不直接用于鉴定，这类方法不直接用于鉴定 常规方法的准确性，只用于常规方法的准确性，只用于评价参考方法与一级标准品评价参考方法与一级标准品。 储氢重量分析仪储氢重量分析仪 ( (北京英格海德分析技术有限公司北京英格海德分析

7、技术有限公司) ) 9优选专业 项目项目决定性方法决定性方法参考方法参考方法 钙钙ID-MS原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 氯氯电量滴定法、中子活化法电量滴定法、中子活化法电流滴定法电流滴定法 镁镁ID-MS原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 磷磷ID-MS 钾钾ID-MS、中子活化法中子活化法火焰光度法火焰光度法 钠钠重量分析法、中子活化法重量分析法、中子活化法火焰光度法火焰光度法 白蛋白白蛋白免疫化学法免疫化学法 总蛋白总蛋白双缩脲法双缩脲法 肌酐肌酐ID-MS、离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析法 尿素尿素ID-MS尿素酶法尿素酶法 尿酸尿酸ID-MS尿酸酶法

8、（紫外法尿酸酶法（紫外法） 胆红素胆红素重氮反应法重氮反应法 葡萄糖葡萄糖ID-MS己糖激酶法己糖激酶法 胆固醇胆固醇ID-MS Abell-Kendall法，胆固醇氧化酶法，胆固醇氧化酶 法法 甘油三酯甘油三酯ID-MS酶法酶法 AST（GOT ） MDH-NADH法法 ALT（GPT）LDH-NADH法法 转肽酶（转肽酶（r-GT）连续监测产物生成法连续监测产物生成法 肌酸激酶肌酸激酶 NAD+偶联法偶联法 10优选专业 二、实验方法选择的目的二、实验方法选择的目的 1.1.结合自身条件，按照实验方法原则选择结合自身条件，按照实验方法原则选择 合适的项目方法合适的项目方法 2.2.临床应用

9、前初步评估方法分析性能和可临床应用前初步评估方法分析性能和可 能引入的误差能引入的误差 11优选专业 三、实验方法选择的原则三、实验方法选择的原则 1.1.实用性：微量快速、费用低廉、易于自实用性：微量快速、费用低廉、易于自 动分析、安全可靠动分析、安全可靠 2.2.可靠性：较高精密度、准确度和较大的可靠性：较高精密度、准确度和较大的 检测能力检测能力 12优选专业 四、实验方法选择的步骤四、实验方法选择的步骤 1.1.提出要求提出要求 2.2.收集资料收集资料 3.3.选择候选方法选择候选方法 4.4.确立质量目标确立质量目标 5.5.进行初步评价进行初步评价 13优选专业 第二节第二节 试

10、剂盒的选择试剂盒的选择 一、试剂盒的类型一、试剂盒的类型 临床生化诊断试剂种类繁多，有液体试剂、干粉试临床生化诊断试剂种类繁多，有液体试剂、干粉试 剂、干片试剂，一次性试剂包等剂、干片试剂，一次性试剂包等 液体试剂：临床应用最为广泛液体试剂：临床应用最为广泛 1.1.液体单试剂液体单试剂 2.2.液体双试剂液体双试剂 二、试剂盒的选购（了解，自学）二、试剂盒的选购（了解，自学） 三、试剂盒的使用（了解，自学）三、试剂盒的使用（了解，自学） 14优选专业 第三节第三节 检测系统性能评价方法检测系统性能评价方法 性能评价主要内容：性能评价主要内容： 精密度、正确度、线性范围、检测限、抗干扰能力、精

11、密度、正确度、线性范围、检测限、抗干扰能力、 生物参考区间等生物参考区间等 15优选专业 在在相同条件相同条件下，对下，对同一样本同一样本连续连续进行进行n次重复测定次重复测定结果的符合程度。结果的符合程度。 在有限次测定情况下，一般用在有限次测定情况下，一般用 （总体标准差）的估计值（总体标准差）的估计值S（样本标准差）（样本标准差） 和变异系数和变异系数CV来表达这种精密度。来表达这种精密度。 定义：定义： 一、精密度评价一、精密度评价 16优选专业 批内精密度试验：批内精密度试验： 指在指在相同条件下相同条件下（同样方法、同一种试剂和标准品、同样仪器、在同一（同样方法、同一种试剂和标准品

12、、同样仪器、在同一 实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对同一标本同一标本在在尽可能尽可能 短的时间短的时间内进行内进行m m轮轮n n次次重复测定结果之间相互接近重复测定结果之间相互接近 的程度。重复性（批内）精密度（的程度。重复性（批内）精密度（S S ） ） Si2 m S S = = Si = = (xt-xt)2 n-1 CV=CV= S S X X 100100 定义：定义： 重复性试验重复性试验是评价精密度常用方法，包括：是评价精密度常用方法，包括： ( (一一) )基本方法基本方法 17优选专业 日间精密度试验日间精

13、密度试验 定义：定义： 将将同一样本同一样本分成数份，分成数份，随机插入随机插入常规患者样本中，每天测定一次，常规患者样本中，每天测定一次， 最少连续测定最少连续测定2020天天，计算均值、标准差、变异系数。，计算均值、标准差、变异系数。 18优选专业 1.1.试验条件稳定试验条件稳定 2. 2.实验标本应与真实标本有同样基质实验标本应与真实标本有同样基质 3. 3.检测系统应处于良好状态检测系统应处于良好状态 ( (二二) )精密度评价注意事项：精密度评价注意事项： ( (三三) )性能可接受性判断：性能可接受性判断： 1.1.国家行业标准国家行业标准WS/T 403-2012 WS/T 4

14、03-2012 2. 2.美国标准美国标准CLIACLIA8888 19优选专业 二、正确度评价二、正确度评价 p定义定义: 1. 大批检测大批检测结果均值与真值结果均值与真值的一致程度的一致程度 2.指指测定结果与真值接近测定结果与真值接近的程度，一般用的程度，一般用偏差和偏差系数偏差和偏差系数表示表示。 p表示方法表示方法: 偏倚为重复测定均值（偏倚为重复测定均值（ X）与真值之差。）与真值之差。 偏偏倚倚系数系数（CB）= 100 。 真值真值-X 真值真值定量的标准品定量的标准品 确认的标准方法确认的标准方法 或或 1.1.正确度正确度 2. 2.准确度准确度 20优选专业 p影响因素

15、：影响因素： 系统误差、随机误差（了解）系统误差、随机误差（了解） 表示已定系统误差的综合表示已定系统误差的综合。 A=+（不确定度不确定度） 不确定度（不确定度（uncertaintyuncertainty）是表达测定结果的一个组成是表达测定结果的一个组成 部分，它表明被测标本中真值存在的范围部分，它表明被测标本中真值存在的范围 21优选专业 特异度和干扰特异度和干扰 即专一性，是指在特定实验条件下即专一性，是指在特定实验条件下分析试剂只对待测物质起反应分析试剂只对待测物质起反应，而，而 不与其它结构相似的非被测物质发生反应不与其它结构相似的非被测物质发生反应。分析方法特异度越高，则测定。分

16、析方法特异度越高，则测定 结果越准确。结果越准确。 p特异度（特异度（specificityspecificity） 是指标本中某些是指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应非被测物质本身不与分析试剂反应但以其它形式但以其它形式使待使待 测物测定值偏高或偏低测物测定值偏高或偏低，这些非被测物质称为干扰物。，这些非被测物质称为干扰物。 p干扰（干扰（interferenceinterference） 特异度特异度干扰干扰 方法的准确性方法的准确性 侧面指标侧面指标正面指标正面指标 22优选专业 （一）重复性试验（一）重复性试验 p试验的目的试验的目的: : p试验的方法试验的方法: : 对对同

17、一材料（标准液、质控液、标本等）同一材料（标准液、质控液、标本等）分成数份试验标本进行分成数份试验标本进行多次分多次分 析测定析测定，并计算其，并计算其均数、标准差与变异系数。均数、标准差与变异系数。 检测候选方法的随机误差检测候选方法的随机误差 （1 1）批内）批内: :标准液标准液 （2 2）日内）日内: : （3 3）日间）日间: :质控液质控液 （4 4）平行双份）平行双份: : p试验的形式试验的形式: : p应注意的问题应注意的问题: : （1 1）分析标本选择）分析标本选择 （2 2）被测物浓度）被测物浓度 23优选专业 ( (二二) )回收试验回收试验 p试验的目的试验的目的:

18、 : p试验的方法试验的方法: : 将被测物标准液加人病人标本中，成为将被测物标准液加人病人标本中，成为分析标本分析标本；原病人；原病人 标本中加人等量的无被测物的溶剂作标本中加人等量的无被测物的溶剂作基础标本基础标本；然后用候选方；然后用候选方 法测定并得到各自浓度。法测定并得到各自浓度。 检测候选方法的比例系统误差。检测候选方法的比例系统误差。 p回收回收: : 指候选方法准确测定指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析加入常规分析标本的纯分析 物物的能力。的能力。 24优选专业 回收浓度回收浓度= =分析标本测得浓度分析标本测得浓度 - - 基础标本测得浓度基础标本测得浓度（实际测得值

19、）（实际测得值） p计算计算: 加入浓度加入浓度= = 标准液量标准液量 病人样品量（病人样品量（mlml）标准液量（）标准液量（mlml） 标准液浓度（理论真实值）标准液浓度（理论真实值） 回收率（回收率（% %）= = 回收浓度回收浓度 加入浓度加入浓度 100100（理想值为）（理想值为） 比例系统误差回收率比例系统误差回收率 真实值测定值真实值测定值 真实值真实值 误差值误差值 真实值真实值 25优选专业 p注意事项：注意事项： 吸量准确；吸量准确； 加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最加入标准液后，其实验样品的被子测浓度最 好达到医学决定水平；好达到医学决定水平； 总浓度必须在方法

20、分析范围内；总浓度必须在方法分析范围内； 需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均需加入高中低不同浓度回收试验，计算平均 回收率；回收率； 加入标准液的体积一般在加入标准液的体积一般在10%10%内；内； 重复重复2-32-3次。次。 26优选专业 干扰试验干扰试验 p试验的目的试验的目的: 用来检测候选方法的用来检测候选方法的恒定系统误差恒定系统误差。干扰物。干扰物浓度浓度不同，不同， 误差大小也不同误差大小也不同 p干扰干扰: 指标本中某些指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应非被测物质本身不与分析试剂反应但以但以 其它形式其它形式使待测物测定值偏高或偏低使待测物测定值偏高或偏低。 27

21、优选专业 p试验的方法试验的方法: 基本与回收试验一样，但在病人标本中加人的是疑有干基本与回收试验一样，但在病人标本中加人的是疑有干 扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定扰或非特异性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定 浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标 本加人相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候本加人相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候 选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质 产生的干扰所引起的误差，即干扰值产生的干扰

22、所引起的误差，即干扰值 干扰值干扰值= =分析标本测得浓度分析标本测得浓度 - - 基础标本测得浓度基础标本测得浓度 p计算计算: 28优选专业 p注意事项注意事项 被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、被试验的物质：胆红素、溶血、防腐剂、抗凝剂、 药物等药物等 可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标可疑干扰物的浓度：干扰物浓度有可能达到病理标 本最高浓度值。本最高浓度值。 本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物作 用引起的误差。用引起的误差。 p消除干扰常用方法消除干扰常用方法 空白对照：空白对照：试剂空白试剂空白：常见：常见 标本

23、空白：内空白法和外空白法标本空白：内空白法和外空白法 物理、化学方法分离干扰物物理、化学方法分离干扰物 双波长或多波长法检测排除干扰双波长或多波长法检测排除干扰 误差较大又无法消除，则改进或更换方法。误差较大又无法消除，则改进或更换方法。 （分析标本就是模拟实际标本）（分析标本就是模拟实际标本） 29优选专业 ( (四四) )方法对比试验（熟悉）方法对比试验（熟悉） p试验的目的试验的目的: : p试验的方法试验的方法: : 对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时进行分析对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时进行分析 测定，观察二者之间的差异。这是考验候选方法是否可采用测定，观察二者之间的

24、差异。这是考验候选方法是否可采用 的重要措施。的重要措施。 用于检测候选方法的系统分析误差。用于检测候选方法的系统分析误差。对所得数据进行分析，对所得数据进行分析， 可提供系统误差的性质（恒定或和比例误差）可提供系统误差的性质（恒定或和比例误差） 30优选专业 在进行临床化学常规方法的评价时，最好选择参考方法作为比较方法在进行临床化学常规方法的评价时，最好选择参考方法作为比较方法 若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差 一致一致 的那部分误差），剩余的则属于侯选方法。的那部分误差），剩余的则属于侯选方法。 若采用未知偏差法，

25、分析误差可能来源于二者之一或两者都有，难以若采用未知偏差法，分析误差可能来源于二者之一或两者都有，难以 分析。分析。 p比较方法的选择：比较方法的选择： p应注意的问题应注意的问题: : p统计处理：统计处理：配对配对t t检验、相关和回归分析检验、相关和回归分析 直线回归处理：直线回归处理： 理想的回归为：理想的回归为： 31优选专业 三、可报告范围评价三、可报告范围评价 定义：观察一种检测方法或一个检测系统的检测范围。定义：观察一种检测方法或一个检测系统的检测范围。 检测范围的要求：覆盖宽，至少应该覆盖医学决定水平检测范围的要求：覆盖宽，至少应该覆盖医学决定水平 （一）实验前准备：（一）实

26、验前准备： 最理想标本：患者的新鲜低值和高值血清标本。多用人工最理想标本：患者的新鲜低值和高值血清标本。多用人工 方法制备。方法制备。 1.试验样本试验样本 2.确定浓度范围确定浓度范围 （二）样本检测：随机排列，每个样本测（二）样本检测：随机排列，每个样本测3-4次次 （三）统计处理（三）统计处理: 32优选专业 33优选专业 五、生物参考区间的验证五、生物参考区间的验证 定义：指某项检查结果在正常人群的分布范围，是解释定义：指某项检查结果在正常人群的分布范围，是解释 检验结果、分析检验信息的基本尺度和依据。检验结果、分析检验信息的基本尺度和依据。 建立生物参考区间的方法建立生物参考区间的方

27、法: （一）（一）实验前准备实验前准备 1. 评价对象的选择评价对象的选择 2.采集标本：采集的注意事项采集标本：采集的注意事项 （二）样本测定（二）样本测定 （三）结果评价：（三）结果评价：95%的可信度的可信度 34优选专业 医学决定水平医学决定水平 p定义：定义： 对临床对临床诊治疾病具有决定性作用诊治疾病具有决定性作用的的被分析物质的浓度被分析物质的浓度，是临床，是临床 上按照上按照不同病情给予不同治疗方案不同病情给予不同治疗方案而确定的而确定的阈值阈值。 p作用：作用： 、判断被检对象有病或完全、判断被检对象有病或完全 排除被检对象有病。排除被检对象有病。 、确定诊断试验在不同病情、

28、确定诊断试验在不同病情 时的变化，需要有治疗及判断时的变化，需要有治疗及判断 预后的界值。预后的界值。 35优选专业 水平水平：提示需要进一步检查的阈值提示需要进一步检查的阈值 水平：提示需要治疗措施的界点水平：提示需要治疗措施的界点 水平：提出预后或要紧急处理的界值水平：提出预后或要紧急处理的界值 一个诊断试验一般确定三个决定水平：一个诊断试验一般确定三个决定水平： 36优选专业 检测系统 是指完成一个检验项目的测定所涉及的仪器、试剂、 校准品、消耗品、操作程序、质量控制程序、设备 维护程序等的组合。 量值溯源 通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结 果或测量标准的值能够与规定的

29、参考标准，通常是与国家测 量标准或国际测量标准联系起来的特性 ISO 17511;VIM：1993，定义6.10 37优选专业 对于临床实验室定量检测来说，最基本的要 求是要保证试验结果足够准确（正确和精 密），以保证临床的正确诊断并且具有时间 和空间的可比性。 38优选专业优选专业 利用参考系统（尤其是参考方法和参考物 质）提高检验结果的准确性和可比性 参考系统是溯源的基础 39优选专业优选专业 制造商工作校准品 制作商产品校准品 常规样品 测定结果 制造商选定测量方法 制造商常设测量方法 临床用户的常规测量 方法 一级参考物 二级参考物 一级参考测量方法 二级参考测量方法 SISI单位单位

30、 不 确 定 度 溯 源 40优选专业优选专业 量值溯源的理想情况是可溯源至国际单位制SI， 要溯源至国际单位，必须有一级参考测量程序 目前满足上述条件的检验指标有25-30种定义明确 的小分子化合物（如某些电解质，代谢产物和底 物类、甾体激素、甲状腺激素） 41优选专业优选专业 检测不能溯源到SI的情况 有国际约定参考测量程序（非一级参考测量程序）和一种 或多种用此参考测量程序定值的国际约定校准物质，如 GHb 有一种国际约定参考测量程序,无国际约定校准物质，如 高密度脂蛋白胆固醇 一种或多种国际约定校准物质及定值方案，无国际约定参 考测量程序，如抗体和肿瘤标记物等300多种指标 既无参考测

31、量程序也无校准的参考物质 42优选专业优选专业 临床实验室的溯源临床实验室的溯源 欲使医学实验室的测量结果具有溯源 性，最直接、简便的途径是进入“不 间断的溯源链” 43优选专业优选专业 参考系统参考系统 包括三个方面 v参考方法 v参考物质 v参考实验室 v其中最主要的是参考物质和参考方法，对于有参 考方法的检验项目，关键又是参考方法 44优选专业优选专业 参考方法分类参考方法分类 参考方法分为 一级参考方法/决定性方法 二级参考方法/参考方法 在临床检验领域所指的参考方法一般为二级 参考方法。 45优选专业优选专业 参考物质参考物质 一级参考物质：高度纯化的分析物 二级参考物质：基质与实际样本相似的参考物质， 二级参考物质一般由二级参考方法定值 46优选专业优选专业 溯源性有关文件溯源性有关文件 ISO17511（2003），体外诊断医学器具生物样本中量的测 量校准物质和质控物质定值的计量学溯源 ISO18153（2003），体外诊断医学器具生物样本中量的测 量 酶催化浓度校准物质和质控物质定值的计量学溯源 ISO15193 （2002），体外诊断医学器具生物样本中量的测 量参考测量程序的表述 ISO151