PCR法获取目的基因PPT课件

1、目 录 PCR技术的创建 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR的类型和应用 PCR法获取目的基因 2021-4-211 2021-4-212 DNA， 生命的蓝图生命的蓝图 2021-4-213 PCR技术技术 Polymerase Chain Reaction 多聚酶链式反应 一、PCR技术的创建 2021-4-214 2021-4-215 Kary B. Mullis（1944） http:/ 三篇重要论文 引物引物 2021-4-216 2021-4-217 1983年春夏之交的一个晚上， Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用引物去扩增模板DNA 的想法。 他开车时,感觉

2、两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成 DNA。 缺点:DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。 2021-4-218 2021-4-219 二、 PCR技术的原理 1.PCR技术的原理 高温变性低 温退火温延伸 （1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物 （2）PCR过程：由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成 变性：94左右，使双链DNA模板解离成为单链； 复性：55左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； 延伸：72左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板， 按碱基配对与

3、半保留复制原理，合成新的DNA链 （3）重复“变性-退火-延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模 板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。 2021-4-2110 复温 2.PCR技术依赖于DNA的变性和复性 2021-4-2111 3.PCR技术的特点 2021-4-2112 三、PCR技术的反应体系和条件 1.反应体系 2021-4-2113 2.基本程序 2021-4-21 14 2021-4-2115 2021-4-2116 2021-4-2117 注意事项 1.EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,并且

4、不要把EB洒到桌面 或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB 的实验垃圾需专门回收处理。 2.观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收 DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外 光切割DNA。 3.每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损 坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 线状DNA分子、环状DNA分子均可； 模板的浓度和纯度是影响PCR的重要因素：模板过多可能增加非特异性产物；纯度不高会影响PCR的效率，甚至 得不到产物。 3.PCR反应条件 2021-4-

5、2118 2021-4-2119 2021-4-2120 3 nTaq DNA聚合酶（thermus aquaticus) ：0.5-2.5 U/50 L体系，所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反 应特异性下降，酶量过少影响反应产量； Taq DNA聚合酶活性的：92.5 130 min；95 40 min；97 5 min； Taq DNA聚合酶的定义：74下，30 min，掺入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量； Taq DNA聚合酶的：一般PCR中出错率为110-5/bp，在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意。 类型：Taq DNA聚合酶

6、普通型，PCR产物末端为A； Pfu DNA聚合酶(Pyrococcus furiosus)高保真，出 错率为110-6/bp，PCR产物为平末端。 2021-4-2121 2021-4-2122 n反应缓冲液（PCR buffer） 组分：一般含10-50 mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8)、50 mmol/L KCl和 适当浓度的Mg2+； TrisCl：在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中, pH为6.8-7.8； 50 mmol/L的KCl：有利于引物的退火； Buffer中加入5 mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 g/mL的牛血清白蛋白

7、(BSA)，可稳定酶活性； 加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利； 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。 nMg2+ 浓度：0.5 mmol/L-2 mmol/L，Mg2+浓度过低会降低Taq酶活性； Mg2+浓度过高影响 反应特异性。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的梯度进行Mg2+预备实 验, 选出最适的浓度； Mg2+的作用：DNA聚合酶的激活剂，可影响酶的活性和真实性,还影响引物退火和解 链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。在PCR反应混合物中，应尽 量减少有高浓度的带负电荷的基团（如磷酸基团、EDTA等可能影响Mg

8、2+离子浓度的 物质），以保证最适Mg2+浓度； dNTP可与Mg2+结合：使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 2021-4-2123 ndNTP（ 4种三磷酸脱氧核苷酸） 浓度：20-200mol/L，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱 基的掺入,浓度过低则降低反应产量；理论上4种dNTP各20mol/L, 就足以在100L反 应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活 性； 四种dNTP浓度应相等，以减少合成中由于某种dNTP不足而导致的掺入错误； dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,

9、影响DNA聚合酶的活性。 dNTP制备：应用NaOH将dNTP溶液的pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓 度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20贮存。 2021-4-2124 2021-4-2125 预变性：94 5 min 变性： 94 20 s-45 s（使双链DNA解链为单链） 退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间为45 s左右。 提高温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。 延伸： 循环次数： 延伸补齐： ，5 min10 min 2021-4-2126 2021-4-2127 2021-4-2128 4.注意事项 PCR应该在一个

10、没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，最好设立一个专 用的PCR实验空间。 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到 可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22m滤膜过滤除菌或 高压灭菌。 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的 量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗 涤干净并高压灭菌。 PCR的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。 2021-4-2129 u阳性

11、对照阳性对照:在建立在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有反应实验室及一般的检验单位都应设有 PCR阳性对照，它是阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是反应是否成功、产物条带位置及大小是 否合乎理论要求的一个重要的参考标志。否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 u阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的 标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝个拷贝 以下以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或但阳性对照尤其是重组质

12、粒及高浓度阳性标本，对检测或 扩增样品污染的可能性很大。因而当某一扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。 2021-4-2130 阴性对照阴性对照:每次每次PCR实验务必做阴性对照。实验务必做阴性对照。它包括它包括标本对照标本对照:经经 确认的阴性标本确认的阴性标本 试剂对照试剂对照:在在PCR反应混合物中不加模板，进行反应混合物中不加模板，进行PCR扩增，以扩增，以 监测试剂是否污染（能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被监测试剂是否污染（能控制贮

13、存试剂可能出现的污染或加样器被 DNA模板的气溶胶污染）。模板的气溶胶污染）。 2021-4-2131 5.防止污染的方法 合理分隔实验室合理分隔实验室:将样品的处理、配制将样品的处理、配制PCR反应液、反应液、PCR循环扩循环扩 增及增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理 及及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分标本处产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分标本处 理区理区;PCR反应液制备区反应液制备区;PCR循环扩增区循环扩增区;PCR产物鉴定产物鉴定 区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线

14、消区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消 毒以破坏残留的毒以破坏残留的DNA或或RNA。 吸样枪吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将 样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样 或吸取模板时要十分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，或吸取模板时要十分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成， 忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 2021-4-2132 预混和分装预混和分装PCR试剂试剂:所有的

15、所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，试剂都应小量分装，如有可能， PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，反应液应预先配制好，然后小量分装，-20保存。以减少保存。以减少 重复加样次数，避免污染机会。另外，重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，试剂，PCR反应液反应液 应与样品及应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性 使用。使用。 设立适当的阳性对照和阴性对照。设立适当的阳性对照和阴性对照。 2021-4-2

16、133 减少减少PCR循环次数，循环次数，只要只要PCR产物达到检测水平就适可而止。产物达到检测水平就适可而止。 选择质量好的选择质量好的Eppendorf管，管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，以避免样本外溢及外来核酸的进入， 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开 管动作要轻，以防管内液体溅出。管动作要轻，以防管内液体溅出。 2021-4-2134 6.实验举例 本实验以含有小鼠基因T10的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增约800bp的产物。 2021-4-2135 nPCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、

17、凝胶电泳系统等仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等 nTaKaRa Taq (5U/ l) 10PCR缓冲器缓冲器 (含含Mg 2+) dNTP混合混合(各各2.5 mmol/L) 模板模板 (10ng，质粒，质粒) 引物（引物（P1和和P2, 10 mmol/L) 实验仪器及材料实验仪器及材料 10PCR缓冲液： (100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 500 mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2) 2021-4-2136 Insert EcoR1 Xho1 pCMV-Myc-T10 2021-4-2137 P1: 5TTCCAAGCTTCACC

18、ATGGCATCAATG CAGAAG C 保护性碱基保护性碱基 Hind III Tm=4（GC）2（AT） 41221170 . P2: 5TCGCGGATCCAGTGGCAGCTT GCTAATCTCATTG 保护性碱基保护性碱基 BamH I Tm=4（GC）2（AT）411213 70 . 2021-4-2138 PCR混合(50 l): 模板: 1 l (10ng) P1: 1 l (10mmol/L) P2: 1 l (10mmol/L) dNTPs: 4 l (2.5mmol/L) Taq polymerase: 0.5 l (5U/l) 10缓冲液（Mg2+）: 5 l dd

19、H2O: 37.5 l 2021-4-2139 PCR条件： 94变性变性5min后开始以下循环后开始以下循环 94变性反应变性反应45 sec； 65退火反应退火反应45 sec； 72延伸反应延伸反应1 min； 进行进行30个循环；个循环； 最后最后72反应反应7min； 4 冷却恒定。冷却恒定。 2021-4-2140 PCR产物分析 取取3-5l PCR产物，采用产物，采用1.2琼脂糖凝胶电泳分琼脂糖凝胶电泳分 析析PCR产物的量，检测引物扩增的特异性，并可产物的量，检测引物扩增的特异性，并可 根据标准脱氧核糖核酸的量粗略计算根据标准脱氧核糖核酸的量粗略计算PCR产物的产物的 总量。

20、总量。 PCRPCR结果：结果： 脱氧核糖核酸标记脱氧核糖核酸标记 PCR产品产品 1.0kb 学生实验结果学生实验结果(4 l) 1.不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物，分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01mol/L： 0.5mol/L，关键是限制性引物的绝对量。 用途： 制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 四、PCR的类型 2021-4-2141 2021-4-2142 2021-4-2143 2.降落PCR(touch-down PCR) 多循环的反应程序使退火温度越来越低。开始的退火温度选择 为高于Tm值，随着循环进

21、行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最 终低于这个水平。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高 出5-10度，然后每个循环递减1-2度。 原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在 温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着 退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 2021-4-2144 3.热起动PCR(hot start PCR) 热起动PCR是除了设计好的引物之外，提高PCR特异性最重要 的方法之一。 尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，但聚合酶在室温 仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环 刚开始，保温温度低于退

22、火温度时会产生非特异性产物。这些非 特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 进行反应之前，先不加Taq酶，等温度上升到72 后再加入 Taq酶。 Platinum DNA聚合酶用于自动热起动PCR。常温活性被封闭， 9495 加热几分钟后才激活其酶活性。 2021-4-2145 4.嵌套PCR(nested primer PCR) 采用两对引物进行采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内，其中第二对引物位于第一对引物内 P1上 P1下P2上P2下 用途：用途：验证第一次验证第一次PCR产物的特异性；产物的特异性； 进行特殊进行特殊PCR，如合成探针模板。，如合成探针模板。 5.反向

23、PCR (reverse PCR) 目的：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 用途：探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆；建立基因组步移文库。 2021-4-2146 6.多重PCR（复合PCR） 目的：用于检测特定基因序列的存在或缺失。 1 2 3 4 1234 2021-4-2147 7.LP-PCR（Labelled primers) 目的：利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观检测目的基因。 用途：特别适合大量临床标本的基因诊断； 可同时检测多种基因成分。 2021-4-2148 202

24、1-4-2149 8.锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） PCR技术需了解靶基因片段两个末端的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？ 2021-4-2150 锚定PCR首先合成第一链cDNA，然后再添加一同聚物尾巴（polydG)，与同聚物尾巴配对 的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 2021-4-2151 9.PCR固相分析法 可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作 2021-4-2152 10.原位PCR 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，ISPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体

25、系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少 的靶序列。 2021-4-2153 （2） 鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏 感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内 基因重排以及分析细胞内RNA的表达

26、产物。 2021-4-2154 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后使得一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）能够进入细胞 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达 2021-4-2155 11.反转录PCR（RT-PCR) 逆转录酶 DNA聚合酶 mRNA cDNA 杂合双链杂合双链 PCR扩增 2021-4-2156 2021-4-2157 12.荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的 软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初

27、始模板量。 2021-4-2158 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons（分子信标） Dual Probes(FRET)荧光共振能量转移 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 2021-4-2159 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需电泳检测 2021-4-2160 全新全新4通道实时

28、荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪 2021-4-2161 T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green 五、PCR技术的应用 1.基因克隆 2021-4-2162 + 2

29、021-4-2163 2.遗传病的诊断 2021-4-2164 A 2021-4-2165 3.恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） 2021-4-2166 2021-4-2167 2021-4-2168 4.基因鉴定 2021-4-2169 2021-4-2170 六、PCR法获取目的基因 1.T载体克隆PCR获取的目的基因 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板 依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对 dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载 体克隆目的基因 2021-4-2171 具有3-5 外切酶活性的DN

30、A 聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进行克隆, 应首先对PCR产 物的3末端进行加A的工作。工作程序如下 方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5l 10Taq DNA Polymerase Buffer、4种dNTP或dATP（终浓度为 200nM）、2.5U Taq DNA Polymerase，加水至终反 应体积为 50l，72 保温10min，纯化 PCR片段后 进行TA克隆。 方案二 PCR 反应（50l 反应体积）结束以后，加入1l 20mM dATP 和2.5U 的Taq 酶，72 保温10min ， 然后进行直接进行TA克隆。 2021-4-2172 2.设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因 3 3 2021-4-2173 http:/ /genetics/