2.荧光光度法测定维生素B2的含量

1、2. 荧光光度法测定维生素 含量 B2 的 实验五 荧光光度法测定维生素 B2 的含量 一、实验目的 1、学习荧光分光光度法测定维生素 B2 的分析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素 B2 的方法。 二、实验原理 1. 荧光光度法原理 （1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分 子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁 的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强 度 IF 与物质的浓度 c 有以下的关系： IF 2.303 I0 bc 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： IF

2、Kc 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 （2）荧光分析法的特点： a. 与紫外 - 可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 （3）荧光光谱 激发光谱：固定测量波长 （ 选最大发射波长 ） ，化合物发射的荧光强度与照 射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大。 发射光谱：固定激发光波长 （ 选最大激发波长 ）, 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描， 找出最大激发光波长， 然后固定激发 光波长进行荧光发

3、射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧 光波长的选择是本实验的关键。 （4）荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分 构成，如下图所示： I0 2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素 B2 的含量 维生素 B2（又叫核黄素， VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： OO HH C 3 H C 3 H 维生素 B2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光 照易分解，对热稳定。维生素 B2溶液在 430440 nm 蓝光的照射下，发出绿色 荧光，荧光峰在 535 nm。维生素 B2在pH=67的溶液中荧光强度最大，

4、 在 pH=11 的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2 的含量。 多维葡萄糖中含有维生素 B1、B2、C、D2 及葡萄糖，其中维生素 C 和葡萄糖 在水溶液中不发荧光，维生素 B1 本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后 才产生荧光，维生素 D2 用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的 测定。 维生素 B2 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的 荧光比核黄素的荧光强的多， 故测维生素 B2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内， 且在避光条件下进行。 三、试剂与仪器 仪器： 970CRT荧光光度计， 5 ml 吸量管1只，2 ml 吸量管1只， 5

5、0 ml 容量 瓶 6 只, 100 ml 容量瓶 1 只， 试剂： 10.0 g/ml (实际浓度请自己记录 )维生素 B2标准溶液，冰乙酸，试样 若干 四、实验步骤 970CRT荧光光度计的基本操作 1. 先打开氙灯，再打开主机 ，然后打开计算机电源，荧光光度计工作站自动 启动并初始化仪器，预热 20 30min 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数例 如：设置激发波长为 440nm，发射波长为 330 nm，灵敏度 2，入射缝宽和出射 缝宽均为 10nm。 3. 样品测定 (1) 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在 6 个干净的 50 ml

6、容量瓶中，分别吸取 0.50 、1.00 、1.50 ，2.00 ，2.50 和 3.00 维生素 B2 标准溶液，各加入 2.00 ml 冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到 不同浓度的溶液分别是： 0.1 ，0.2 ，0.3 ，0.4 ，0.5 ，0.6ug/ml 的维生素 B2溶液， 从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 (2) 未知试样的测定 : 准确称取一片维生素 B2片,用研钵研细，加 少量水溶解 后(不得超过定容 体积)，将其全部转入 50 ml 比色管中，于超声振荡器中超声溶解后，定容。 将超声分解后的样品试液经 0.45 m膜过滤后 ,准确取滤液适量置于 50 ml 比色管中，加

7、2.00 ml 冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的 条件，平行测量其荧光强度 3 次。 黑体字部分实验报告中请按自己实际操作撰写） 4. 定性实验：改变狭缝宽度、灵敏度、扫描速度，记录发射光谱曲线，进行实 验条件的讨论。 5. 退出主程序，关闭计算机， 先关主机，最后关氙灯。 五、实验结果及数据处理 1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中 含量。 六、思考题 1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因 ? 2. 维生素 B2在 pH67 时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 3. 如何绘制激发光谱

8、和荧光发射光谱 ? 五实验结果及数据处理 1 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 表一 CB2/ g/ml 0.186 0.372 0.558 0.744 0.930 1.116 INT 45.255 88.435 132.581 178.361 215.736 269.552 INT 标准曲线 图一 2. 根据待测液的荧光强度从标准工作曲线上求 得其浓度计算出试样中含量 样品荧光强度 表二 mB2=0.0681g 类别 组别 1 2 3 平均值 A 234.354 234.357 234.359 234.3567 B 233.541 234.411 233.557 233.8363 C

9、 232.405 233.794 234.175 233.458 总体平均 值 233.8836667 根据表二 INT 总体平均值 =233.8836667 ，由图一标准曲线得 CB2=0.9825 g/ml 100% 7.2% 峰越宽； VB2含量 CB2 50 100 10-6 mVB2片 3. 定性分析实验结论 灵敏度越大，峰越高， 扫描速度改变，峰高不变，峰宽不变； EX缝宽变小，峰高变大，峰变宽； EM缝宽变大，峰变高，峰变宽。 六思考题。 1. 试解释荧光光度法较吸光光度法灵敏度的原 因。 答: 荧光光度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可成倍提高荧光强度， 同时提高仪器的灵敏 度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸 光光度法无论是提高激发光强度还是提高仪器 灵敏度， 入射光和出射光同时增大， 吸光光度法 的灵敏度不变，因此荧光光度法较系光棍光度法 灵敏度高。 2. 维生素 B2在 PH=6-7 时荧光最强，本实验为何 在酸性溶液中测定？ 答：维生素 B2 在碱性溶液中景光线照射会发生分 解而转化为光黄素， 光黄素的荧光比核黄素的荧 光强的多，故测维生素 B2 的荧光时要控制在酸性 范