布鲁氏菌试管凝集试验[行业特制]

1、布鲁氏菌血清学检验布鲁氏菌血清学检验 山西省疾病预防控制中心山西省疾病预防控制中心 张秋香张秋香 1讲课材料 免疫学基础免疫学基础 2讲课材料 n由于布鲁氏菌培养的营养条 件苛刻而且时间长，所以布 鲁氏菌的血清学诊断越来越 受到重视。 3讲课材料 主要是根据相应抗原抗体可以主要是根据相应抗原抗体可以 在体外发生特异性结合并呈现可见在体外发生特异性结合并呈现可见 反应的原理反应的原理,用已知抗原用已知抗原(或抗体或抗体)检检 测体液中未知的抗体测体液中未知的抗体(或抗原或抗原).由于由于 试验时通常是用患者血清作为待检试验时通常是用患者血清作为待检 材料材料,所以检测抗原抗体的体外试所以检测抗原

2、抗体的体外试 验又称为血清学试验或血清学反应验又称为血清学试验或血清学反应. 4讲课材料 n血清学检查既可协助早期诊断，还可血清学检查既可协助早期诊断，还可 确定是否复发或重复感染。确定是否复发或重复感染。 n感染感染1-2周后，患者血清中出现周后，患者血清中出现IgM抗抗 体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试 验检测验检测 n感染周后，患者血清中出现感染周后，患者血清中出现IgG抗体，抗体， 可以用补体结合试验，荧光抗体或可以用补体结合试验，荧光抗体或 ELISA检测检测 5讲课材料 虎红平板的凝集反应（虎红平板的凝集反应（RBPT） 6讲课材料 原理原理 n该试

3、验又称为班氏孟加拉红平板凝集该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集 试验。由于所用的抗原是酸性试验。由于所用的抗原是酸性 （PH3.63.9）带色的抗原，该抗原）带色的抗原，该抗原 与被检血清作用时能抑制血清中的与被检血清作用时能抑制血清中的IgM 类抗体的凝集活性、检查出的抗体是类抗体的凝集活性、检查出的抗体是 IgG类，因此提高了该项反应的特异性。类，因此提高了该项反应的特异性。 7讲课材料 器材与试剂器材与试剂 n虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂 玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量 加样器、混合棒或牙签 8讲课材料 试验方法试验方法 n在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎 红

4、平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内 观察结果。 9讲课材料 (四四) 结果判定结果判定 n有二种方法，第一种是，出现可见的凝集反应就判为阳 性； n另一种用“+”表示凝集程度按下列标准用加号记录反应 强度： n+：出现大的凝聚片或小的粒状物，液体完全透明， 100%凝集 n+：有明显的凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集 n+：有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集 n+：液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集 n-：液体均匀混浊 10讲课材料 评价评价 n此法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检 疫； n此法有一定敏感性，检查牛的阳性率稍高于绵羊、 山羊。 n因为在酸性环境下IgM

5、活性受抑，该法主要是检 查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合 试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白 （Coombs0）试验有较高的吻合率。 n该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备 抗原应予以检查、标化方可应用。 11讲课材料 12讲课材料 试管凝集试验 13讲课材料 试管凝集试验的原理 1897年莱特氏等(Wright)与其同 事发现患该病的病人血清与马尔 他细菌的培养物产生了凝集现象， 遂称之为莱特氏凝集反应，成了 迄今常用的血清学诊断方法之一。 14讲课材料 设备及试剂 n试管凝集抗原 n被检血清 n0.5%的石碳酸生理盐水 n吸管 n试管 n试管架 n孵箱 15讲课

6、材料 操作步骤 n被检血清的稀释:一般情况下,每份血清用5支小试 管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不 加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸 管吸取被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混 匀后, 以该吸管吸取第一管中血清加入第二和第 三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸 取0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后 从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第二管 起血清稀释度分别为1:12.5 1:25 1:50 1:100 16讲课材料 操作步骤 n加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做 适当稀释（一般是作1:10稀释）,稀释后的抗原加 入各

7、稀释的血清管（第一管不加，作为血清对 照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至 第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度 分别为1:25 1:50 1:100 1:200，从第一管再吸出 0.5毫升，剩1毫升。 n对照管的制作: n抗原对照（适当稀释的抗原加石碳酸盐水） n被检血清对照 n阴性对照（阴性血清稀释后加抗原） n阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原） 17讲课材料 n然后将试验管和对照管充分 混匀后，放于37温箱中 20-22小时后取出，在室温 下放置2个小时，以比浊管 为标准判定结果。 18讲课材料 结果的判定 n判定比浊管的制备判定比浊管的制备:每次试验须配制比浊

8、每次试验须配制比浊 管作为判定的标准依据管作为判定的标准依据. n配制方法是配制方法是:取本次试验用的抗原稀释液取本次试验用的抗原稀释液 （一般（一般1:10）5-10毫升，加入等量的毫升，加入等量的 0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下 表配制比浊管表配制比浊管 n比浊管的配制比浊管的配制 19讲课材料 试管凝集反应标准比浊管配制 n管号管号 抗原稀释液（抗原稀释液（ml） 生理盐水（生理盐水（ml） 透明度透明度 标记标记 n1 0.00 1.00 100% + n2 0.25 0.75 75% + n3 0.50 0.50 50% + n4 0.75 0.

9、25 25% n5 1.00 0.00 0% 20讲课材料 结果记录 n根据各管中上层液体的清亮程度记录结果，根据各管中上层液体的清亮程度记录结果， 特别是特别是50%清亮度（清亮度（+）对判定结果关系）对判定结果关系 较大，一定要与比浊管对比判定较大，一定要与比浊管对比判定 n血清对照为清亮透明无沉淀血清对照为清亮透明无沉淀,抗原对照为均抗原对照为均 匀混浊在两种对照管都成立的情况下，才匀混浊在两种对照管都成立的情况下，才 可判定试验管，否则应重做。对沉淀需要可判定试验管，否则应重做。对沉淀需要 经验判定。经验判定。 21讲课材料 n “+” 几乎完全凝集，上清液几乎完全凝集，上清液75%清

10、亮清亮 n“+”显著凝集，上清液显著凝集，上清液50%清亮清亮 n“+” 微量凝集，液体微量凝集，液体25%清亮清亮 n “-” 无凝集，液体不清亮无凝集，液体不清亮 n确定每份血清滴度是以出现确定每份血清滴度是以出现“+”及以上的及以上的 凝集现象的最高血清稀释度凝集现象的最高血清稀释度 n“+”完全凝集，上清液完全凝集，上清液100%清亮清亮 22讲课材料 诊断标准 n没有进行过菌苗接种的人、畜血清试验的标准是： n人、牛、马、鹿、骆驼等大家畜血清为1： 100( +)及以上者为阳性，1：50(+)为可疑。 n猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清在1： 50(+)及以上者为阳性，1：25(

11、+)为可疑。 n对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查， 以便进一步确定诊断。 23讲课材料 影响试验结果的因素及注意事项 n 受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处 温度不能超过10，采血后应于34日内进行检 查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。 n 遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂 的加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要 按要求，否则都影响结果。每份血清和抗原均要 有对照。 n高渗盐水作凝集反应，一般浓度在1012%，一 般切记人血清不能用高渗盐水。 24讲课材料 n作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即 稀释度

12、低的血清管内稀释度低的血清管内(或血清量多的格或血清量多的格)不发生凝不发生凝 集，而稀释度高的管内集，而稀释度高的管内(或血清量少的格或血清量少的格)出现凝出现凝 集，这叫做前带现象。如果某血清在平板凝集反集，这叫做前带现象。如果某血清在平板凝集反 应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做 几个管，多采用几个稀释度。几个管，多采用几个稀释度。 n 氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐 的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界 为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干

13、扰，对羊血为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血 清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在 1012%，切记一般人血清不能用高渗盐水。，切记一般人血清不能用高渗盐水。 25讲课材料 n 前带现象产生的原因前带现象产生的原因 n 胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子 多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含 胶体粒子少，所以出现凝集。胶体粒子少，所以出现凝集。 n 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞 争抗原，所以在低稀释度的管中

14、不凝集。争抗原，所以在低稀释度的管中不凝集。 n 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内 含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产 生，封闭抗原的干扰。生，封闭抗原的干扰。 26讲课材料 评价 n该方法特异性较好，敏感性也高，因此适该方法特异性较好，敏感性也高，因此适 用于检疫和临床诊断。用于检疫和临床诊断。 n由于该试验有时出现前带现象和封闭现象，由于该试验有时出现前带现象和封闭现象， 所以有时也出现假阴性结果，必要时和其所以有时也出现假阴性结果，必要时和其 它方法联合应用。它方法联合应用。 27讲课材料

15、n抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点 28讲课材料 抗原抗体结合的特异性抗原抗体结合的特异性 抗原抗体结合的基础是抗原决定簇与抗体抗原抗体结合的基础是抗原决定簇与抗体 的抗原结合部位之间的抗原结合部位之间 的反应的反应.这种反应是专这种反应是专 一性的一性的.例如例如:布氏杆菌只能与布氏杆菌抗体布氏杆菌只能与布氏杆菌抗体 相结合相结合,而不能与痢疾杆菌抗体相结合而不能与痢疾杆菌抗体相结合. 29讲课材料 抗原抗体抗原抗体 结合的表面性结合的表面性 n抗原抗体的结合仅仅是分子表面的结合， 虽然两者的结合相当稳定，但结合后的抗 原抗体，其本身的结构，生物学活性均未 遭到破坏,并且在一定条件下可解

16、离.即抗原 抗体的结合是可逆的,所以,解离抗原抗体复 合物的方法可用于 提取,纯化抗原或抗体. 30讲课材料 抗原抗体结合的适当比例抗原抗体结合的适当比例 抗原是多价的抗原是多价的(分子表面有多个抗原决定簇分子表面有多个抗原决定簇)，抗体，抗体 一般是双价的，一般是双价的，(分子的末端有两个抗原结合部分子的末端有两个抗原结合部 位位)，所以，二者的结合就有一个比例关系问，所以，二者的结合就有一个比例关系问 题只有抗原抗体比例适当，才能形成较大的，题只有抗原抗体比例适当，才能形成较大的， 容易观察的复合物如若比例不当容易观察的复合物如若比例不当,就不能形成较就不能形成较 大复合物大复合物.所以试

17、验时要根据不同情况对抗原抗体所以试验时要根据不同情况对抗原抗体 (甚至两者同时甚至两者同时)进行连续稀释进行连续稀释,以便更好地提供两以便更好地提供两 者最适的比例者最适的比例.颗粒性抗原颗粒性抗原,因其分子较大因其分子较大,形成可形成可 见的凝集物质所需的抗体较少见的凝集物质所需的抗体较少,所以试验时一般把所以试验时一般把 含有抗体的血清做连续稀释含有抗体的血清做连续稀释,尽管如此尽管如此,有时还能有时还能 在含有较多抗体的前列试管中在含有较多抗体的前列试管中,因两者比例不当不因两者比例不当不 呈现可见反应呈现可见反应,这种现象被称为前带现象这种现象被称为前带现象. 31讲课材料 抗原抗体结

18、合的阶段性抗原抗体结合的阶段性 抗原抗体的结合分为两个阶段抗原抗体的结合分为两个阶段 第一阶段第一阶段:特异性结合阶段特异性结合阶段,反应快反应快, 只需几秒或几分即可完成只需几秒或几分即可完成.但不出现但不出现 肉眼可见的反应肉眼可见的反应. 第二阶段第二阶段:抗原抗体结合的可见阶段抗原抗体结合的可见阶段, 这一阶段的反应是可见的这一阶段的反应是可见的,反应较慢反应较慢, 常需几分钟，几十分钟或更久。常需几分钟，几十分钟或更久。 32讲课材料 抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素 n电解质；抗原抗体反应必须有适量的电解质参加，否则不电解质；抗原抗体反应必须有适量的电解质参加，否则不 出现可见反应，一般拿出现可见反应，一般拿0.85化钠溶液做为抗原或抗体的稀化钠溶液做为抗原或抗体的稀 释液。释液。 n温度：适当提高温度可以增多抗原与抗体的碰撞机会。促温度：适当提高温度可以增多抗原与抗体的碰撞机会。促 进反应现象加速出现。一般最适温度范围在进反应现象加速出现。一般最适温度范围在0-56之间。在之间。在 这个范围内，温度低，对反应的促进作用较小，但生成的这个范围内，温度低