基因工程酶学基础

1、http:/ http:/ http:/ 核酸酶：生物体内存在一类对DNA和RNA作用的酶。 DNA酶： RNA酶： 限制性内切酶：能使DNA分子在内部特定的位点上断裂 的酶。 核酸外切酶：从DNA分子末端移去核苷酸的酶。 反转录酶：以mRNA为模板合成出互补DNA的酶。 DNA连接酶：能使DNA分子连起来的酶。 http:/ v1、掌握一些重要的酶的概念、特点、反应特征和应用。 v2、掌握一些重要的酶的作用机制及应用。 v3、掌握DNA的片断化、连接和重组的一些方法、技术及应用。 http:/ 本章的主讲内容（6学时，3次课） http:/ 要点介绍 1、了解并掌握一些基本概念的掌握如 ht

2、tp:/ http:/ 主要为细菌、 少数霉菌和蓝藻 http:/ http:/ http:/ http:/ R/MR/M体系体系 R/M体系组成： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解 http:/ 来源 识别序列 切割位点 作用机制 基因工程中的应用 http:/ www./ rebase数据库 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ 教材P39 http:/ http:/ 教材P39 http:/ http:/ http:/ http:/ ht

3、tp:/ http:/ http:/ http:/ http:/ P46 在PH不合适，或甘油浓度过高10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性， 因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ 四、酶切反应 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ 要点： 连接酶的种类 特征和区别 反应机制 影响反应的因素 http:/ 科学家发现细胞中线状的 DNA 分子经常能够自动环化起来， 形

4、成稳定的环状结构。而在 体 外，线状的DNA分子虽然也 能 够自动环化起来，如果没有 任 何其它酶的作用，这种结构 将 是很不稳定的，容易在加热 后 重新解开成线状。1967年， 世 界上有数个实验室几乎同时 发 现了一种能够催化两条DNA 的 末端之间形成磷酸二酯键的 酶，即DNA连接酶。 http:/ E.coli DNA 连接酶 DNA连接酶 是由大肠杆菌染色体编码的 T4 DNA连接酶， 是由大肠杆菌T4噬菌体 DNA编码的。 连接酶的来源 P21 http:/ 两种酶的区别？ 表2-4 1、两种酶来源不同。 2、两种酶的作用机理不同（能源辅助因子不同）。 3、DNA体外连接方式不同。

5、 (1)、用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断。 4、作用对象不同。 (2)、用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来， 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上 poly(dA)-poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起 来. http:/ http:/ DNA连接酶 NAD+ T4 DNA连接酶 ATP 教材P22 http:/ http:/ 体系-反应程序 http:/ http:/ 理解DNA修饰酶的作用 掌握DNA修饰酶的种类、特征、区分 掌握DNA修饰酶的用途 http:/ v 在DNA的切割与连接过程中，经 适当的限制性核酸内切酶处理

6、或机械 法处理产生的DNA片段，其末端是各种 各样的。相同的粘性末端容易连接， 而其它类型的末端连接都比较困难， 在适当的情况下必须对这些末端进行 各种“修饰打扮”，才有可能被连接 酶顺利地连接起来。 v 生物体内存在着各种类型的修饰 酶，能为DNA或RNA分子的末端进行各 种“修饰打扮”，如末端脱氧核糖核 苷酸转移酶、T4多核苷酸激酶和碱性 磷酸酶等等。 http:/ 1） 碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌或小牛肠道，可以去掉DNA分子的5端的磷酸 基团。 2） T4多核苷酸激酶： 来自于T4侵染的大肠杆菌，它能催化-磷酸从ATP分子 上转移给DNA或者RNA的5-OH末端，在5端增加磷酸基团 3

7、） 末端脱氧核苷酸转移酶：来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个 或多个脱氧核苷酸。 http:/ 末端转移酶，是从小牛胸腺中提取的。该酶能催化 5脱氧核糖核苷酸进行53方向的聚合作用， 逐个地将脱氧核糖核苷酸分子加到线性DNA分子的 3-OH末端，给DNA的3-OH末端加上一个多脱氧 核糖核苷酸的同聚物尾巴。 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ T4多核苷酸激酶在DNA分子克 隆中的主要用途是：标记分 子的5-末端；使缺失5- P末端的DNA补上磷酸，发生磷 酸化 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ h

8、ttp:/ http:/ http:/ http:/ 了解一些其它酶的作用和用途 http:/ 核酸外切酶 基因操作过程中经常要针对性地降解掉DNA双链 中DNA-RNA杂种双链分子中的一条链，以满足某些特 殊的实验要求，达到特殊的实验目的。这时会经常 用到一些核酸外切酶。 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始 按序催化降解核苷酸的酶。按作用的特性差异可以 将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 P53 http:/ 发夹结构 http:/ http:/ DNA聚合酶 http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ http:/ 核酸酶：生物体内存在一类对DNA和RNA作用的酶。 DNA酶： RNA酶： 限制性内切酶：能使DNA分子在内部特定的位点上断裂 的酶。 核酸外切酶：从DNA分子末端移去核苷酸的酶。 反转录酶：以mRNA为模板合成出互补DNA的酶。 DNA连接酶：能使DNA分子连起来的酶。 http:/ http:/ R/MR/M体系体系 R/M体系组成： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解 http:/ http:/ http:/ E.coli DNA 连接酶 DNA连接酶 是由大