基因工程研究策略和实践课件

1、基因工程研究策略和实践1 基因工程研究策略基因工程研究策略和实践和实践 基因工程研究策略和实践2 基因决定性状基因决定性状 青霉素能产生青霉菌青霉素能产生青霉菌 家蚕能吐出蚕丝为人类利用家蚕能吐出蚕丝为人类利用 基因工程研究策略和实践3 定向改造基因的设想定向改造基因的设想 1. 能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝？蚕丝？ 2. 能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等 昂贵药物？昂贵药物？ 经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于2020世纪世纪 7070年代创立了可以定向改造生物年代创立了可以定向改造生物 DNADNA的技术的技术- -基因工程基因工程

2、 基因工程研究策略和实践4 基因工程的概念基因工程的概念 将获取的目的基因片段在体外与载体将获取的目的基因片段在体外与载体DNADNA通过通过 人人工剪切、工剪切、连连接构成接构成DNADNA重组体，将其导入受体细重组体，将其导入受体细 胞并使之无性繁殖（称之为胞并使之无性繁殖（称之为“克隆克隆”）和表达，）和表达， 这种有目的的应用分子克隆技术这种有目的的应用分子克隆技术, ,人为的改造基因人为的改造基因、 改变生物的遗传性状的系列过程改变生物的遗传性状的系列过程, ,总称为基因工程总称为基因工程。 基因工程别名基因工程别名DNA重组技术重组技术 操作环境操作环境生物体外生物体外 操作对象操

3、作对象基因基因 操作水平操作水平DNA水平水平 基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达 结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物 基因工程研究策略和实践5 基因工程过程示意图基因工程过程示意图 基因工程研究策略和实践6 基因工程的研究策略基因工程的研究策略 一、目的基因的一、目的基因的分离分离( donor DNA ) ( donor DNA ) 二、载体二、载体DNADNA及其改造及其改造(Vector DNA)(Vector DNA) 三、体外三、体外DNADNA重组重组(DNA recombination )(DNA recombination ) 四、重组四、重组DNAD

4、NA的转化的转化( Transformation)( Transformation) 五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增 ( identification & clone amplification)( identification & clone amplification) 六、目的六、目的DNADNA在受体细胞中的表达在受体细胞中的表达(gene expression)(gene expression) 基因工程研究策略和实践7 一、目的基因的一、目的基因的分离分离 从从cDNAcDNA文库文库中分离中分离目的基因目的基因 从基因组从基因组DNADNA文库文库中

5、分离中分离目的基因目的基因 PCRPCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段 化学方法人工合成基因化学方法人工合成基因 基因工程研究策略和实践8 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 逆逆转录酶转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 1.从从cDNA文库文库中分离中分离目的基因目的基因 逆转录酶逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶 碱水解碱水解 T T T T 基因工程研究策略和实践9 cDNAcDNA文库仅包含正在表达的基因文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的不同物种、不同组织的cDNA

6、cDNA文库不相同文库不相同 基因总量少，易筛选基因总量少，易筛选 基因工程研究策略和实践10 组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA 基因片断基因片断 克隆载体克隆载体 重组重组DNA分子分子 含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌 限制性内切酶限制性内切酶 受体菌受体菌 基因组基因组DNADNA文库文库 存在于转化细胞内存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所 有基因组有基因组DNADNA的集合的集合 2. 2. 从基因组从基因组DNADNA文库文库 获取目的基因获取目的基因 基因工程研究策略和实践11 包含所有遗传信息包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）

7、构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况用于研究基因在基因组中的情况 基因工程研究策略和实践12 3 3、PCRPCR扩增目的基因片段扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因适用于克隆序列清楚的基因 以基因组以基因组DNADNA为模板，直接进行为模板，直接进行PCRPCR扩扩 增较难增较难 多采用以多采用以mRNAmRNA为模板的为模板的RT-PCRRT-PCR法法 PCR扩增仪 基因工程研究策略和实践13 4. 化学合成法获取化学合成法获取较短的较短的目的基因目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列 基因工

8、程研究策略和实践14 二、载体二、载体DNADNA 载体载体 (Vector) 载体是目的基因的运载体是目的基因的运 载工具，其作用是将目的载工具，其作用是将目的 基因带入受体细胞中，并基因带入受体细胞中，并 使目的基因扩增和表达。使目的基因扩增和表达。 常用载体常用载体 质粒质粒 病毒载体病毒载体 噬菌体噬菌体 粘性质粒粘性质粒 / /粘粒粘粒 基因工程研究策略和实践15 载体的选择标准载体的选择标准 有复制起点，有复制起点，能自主复制；能自主复制； 具有具有筛选筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定；标记，便于重组体的筛选和鉴定； 具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位具有一种或多种限制性内切酶

9、的单一切割位 点，并在位点中插入外源基因后，不影响其点，并在位点中插入外源基因后，不影响其 复制功能；复制功能； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。 表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启 动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。 基因工程研究策略和实践16 克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增序列被扩增而特而特 意设计的载体称为意设计的载体称为克隆载体。克隆载体。 表达载体表达载体(expre

10、ssion vector) (expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可序列可转录翻译转录翻译 成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。表达载体。 载体的载体的分类分类 - - 按作用分按作用分 基因工程研究策略和实践17 穿梭载体穿梭载体(shuttIe vector)(shuttIe vector) 又称又称双功能载体双功能载体(bifunctional vector)(bifunctional vector)。能。能 在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体 。其可同时具有细菌质粒

11、的复制原点和真核生其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生 物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制 序列（序列（ARSARS），它即能在），它即能在原核细胞中扩增原核细胞中扩增又能又能 在在真核细胞中复制和表达真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞。主要用于原核细胞 与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物和待克隆的真核生物DNADNA片段先在细菌中克隆片段先在细菌中克隆 ，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基 因的表达效因的表达效 率。如率。如pKSV

12、pKSV一一1010、pJDB219pJDB219载体等载体等 。 基因工程研究策略和实践18 载体的载体的分类分类 - - 按来源分按来源分 质粒质粒(plasmid vector)(plasmid vector) 病毒病毒(virus vector )(virus vector ) 噬菌体噬菌体(phage vector)(phage vector) 粘性质粒粘性质粒 / /粘粒粘粒(cosmid vector)(cosmid vector) 基因工程研究策略和实践19 1. 质粒载体质粒载体: (1)分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。 (2)松驰型松

13、驰型。 (3)具有一个以上的标志，便于筛选。具有一个以上的标志，便于筛选。 (4)具有数个或一个单一的酶切点。具有数个或一个单一的酶切点。 天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实 际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是 pBR322 ,pUC19.， 基因工程研究策略和实践20 常用的质粒载体常用的质粒载体 pBR322pUC118/119 基因工程研究策略和实践21 2 2病毒载体病毒载体 （1 1）整合型载体整合型载体：外源基因通过这种病毒载外源基因通过这种病毒载 体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主体

14、与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主 细胞基因组的复制而扩增。细胞基因组的复制而扩增。 （2 2）游离型载体游离型载体：能够以病毒颗能够以病毒颗粒粒的形式在的形式在 宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。 如：如：腺病毒。腺病毒。 基因工程研究策略和实践22 3.3.噬菌体载体噬菌体载体 现用的现用的噬菌体载体都是在野生型基础噬菌体载体都是在野生型基础 上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：上改造而成的。改建之后的常用载体有两类： 插入型载体插入型载体，具有一个可供外源，具有一个可供外源DNADNA插入插入 的克隆位点，的克隆位点，只能插入较小

15、的外源只能插入较小的外源DNA片段片段 (10kb)。如如gt10gt10、gt11gt11； 替换型载体替换型载体，具有成对的克隆位点，在两，具有成对的克隆位点，在两 个位点之间的个位点之间的DNADNA区段可被外源插入的区段可被外源插入的DNADNA 片段取代，片段取代，能插入较大的外源能插入较大的外源DNA片段片段(20- 24kb左右左右)。如如charon4charon4、charon10charon10。 基因工程研究策略和实践23 4.4. CosmidCosmid质粒质粒 由由DNA cosDNA cos区与质粒重组建造而成区与质粒重组建造而成。在在 宿主细胞中可以作为正常噬菌

16、体进行复制，但宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但 不表达噬菌体的任何功能。不表达噬菌体的任何功能。 分子分子量量小小（约约46kb46kb），可容纳大至，可容纳大至40-40- 50kb50kb的外源的外源DNADNA片段。适用于构建真核细胞的片段。适用于构建真核细胞的 基因文库。基因文库。 如如 cosmid pHC79 cosmid pHC79 基因工程研究策略和实践24 三、体外三、体外DNADNA重组重组 概念：概念： 不同来源的不同来源的DNADNA片段片段共价连接共价连接、通过重新组合、通过重新组合 构成了具有两个构成了具有两个DNADNA分子遗传信息的新分子遗传信息的新重组

17、体重组体DNADNA 分子的过程。分子的过程。 分类：分类： 粘末端连接粘末端连接 平齐末端连接法平齐末端连接法 同聚物核苷酸末端法同聚物核苷酸末端法 人工接头连接人工接头连接 T-AT-A克隆克隆 基因工程研究策略和实践25 限制性内切酶限制性内切酶 “分子剪刀分子剪刀” 型限制型限制性内切性内切酶酶，能专一地识别能专一地识别DNADNA分分 子上特定的碱基序列并将子上特定的碱基序列并将DNADNA切断的内切切断的内切 酶。酶。识别序列的特点识别序列的特点；(I)(I)专一；专一；(2)(2)常由常由4 46 6 个碱基组成；个碱基组成； (3) (3)具有回文序列具有回文序列 经切割可以生

18、成平头末端或粘性末端经切割可以生成平头末端或粘性末端。 可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作 同尾酶。同尾酶。 基因工程研究策略和实践26 基因工程研究策略和实践27 DNADNA连接酶连接酶“分子针线分子针线” 连接双链连接双链DNA分子分子 中相邻中相邻3- - OH和和5- - 磷酸基之间的磷酸磷酸基之间的磷酸 二酯键的形成。二酯键的形成。 最常用的是最常用的是T4T4连接连接 酶，酶，可以连接可以连接粘性粘性 末端和末端和平头末端平头末端。 基因工程研究策略和实践28 1. 1. 粘末端连接粘末端连接 （a）目的基因和载体用目的基因和载体用同一种

19、限制酶切割同一种限制酶切割后连接。后连接。 载体易载体易自身环化自身环化。 用用碱性磷酸酶碱性磷酸酶( (能除掉能除掉DNA-5DNA-5端端P P基团，使基团，使5 5 端带一端带一OH)OH)处理载体，可防止载体自身环化。处理载体，可防止载体自身环化。 （b b）目的基因和载体用）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切两种产生粘末端的限制酶切 割割后连接，可控制目的基因的插入方向后连接，可控制目的基因的插入方向( (定向克隆定向克隆) ) 基因工程研究策略和实践29 Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶连接酶 15C GATCC G G CCTAG

20、目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 载体载体DNA用用Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 重组体重组体 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 载体自连载体自连 目的基因自连目的基因自连 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 基因工程研究策略和实践30 不同限制

21、酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接 GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA Eco R切割位点切割位点 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A Bg l切割位点切割位点 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG EcoR+ Bg l 双酶切双酶切 Eco R+ Bg l 双酶切双酶切 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 基因工程研究策略和实践31 2 2. . 平齐末端连接平齐末端连接 优点：可连接任何一对优点：可连接任何一

22、对DNADNA 可恢复一个酶切位点或产生一个新酶可恢复一个酶切位点或产生一个新酶 切位点切位点 缺点：连接率低缺点：连接率低 要求连接酶及底物浓度高要求连接酶及底物浓度高 GAA GAA 基因工程研究策略和实践32 3 3. . 同聚物核苷酸末端法同聚物核苷酸末端法 在在DNADNA或或RNARNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。 应用末端转移酶在应用末端转移酶在DNADNA片段片段33末端制备粘末端。末端制备粘末端。 避免自身环化避免自身环化 互补序列较长时（互补序列较长时（4bp)4bp)，不需连接酶，不需连接酶 基因工程研究策略和实践33 基因工程研究策略

23、和实践34 4. T-A4. T-A克隆克隆 T-vectorT-vector两条链的两条链的5 5端含端含 有一个游离的有一个游离的T T PCRPCR过程中增加延伸时过程中增加延伸时间间， TaqTaq酶可在产物的酶可在产物的3 3端多加端多加 一个一个A A 基因工程研究策略和实践35 受体菌条件受体菌条件 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态(competent) (competent) 导入方式导入方式 转化转化 (transformation)(transformation) 转染转染 (transfection)(transfectio

24、n) 感染感染 (infection)(infection) 四、重组四、重组DNADNA的转化的转化 基因工程研究策略和实践36 1. 1. 基本概念基本概念 转化（转化（transformationtransformation）：把以质粒为载体构：把以质粒为载体构 建的重组建的重组DNADNA，在一定条件下引入受体细胞的过，在一定条件下引入受体细胞的过 程。程。 转染转染（transfectiontransfection）：以噬菌体或病毒构建：以噬菌体或病毒构建 的重组的重组DNADNA引入受体细胞的过程。引入受体细胞的过程。 感染（感染（infectioninfection）：）：病毒或

25、重组病毒病毒或重组病毒DNADNA进入进入 细胞的过程。细胞的过程。 转化子：转化子：又称工程菌，即接受了重组又称工程菌，即接受了重组DNADNA的受体的受体 菌。菌。 基因工程研究策略和实践37 2.2.受体细胞感受态受体细胞感受态 感受态感受态(competent) ：细胞最易摄取细胞最易摄取 和和“容忍容忍”外来外来DNADNA的生理状态。的生理状态。 致敏：致敏：诱导细胞进入感受态的操作诱导细胞进入感受态的操作。 基因工程研究策略和实践38 转化转化动物细胞常用的动物细胞常用的方法方法 1.1.磷酸钙共沉淀法；磷酸钙共沉淀法； 2.DEAE- 2.DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；

26、葡聚糖或聚阳离子促进吸收法； 3. 3.脂质体转染法；脂质体转染法； 4. 4.电穿孔法；电穿孔法； 5. 5.病毒转染法；病毒转染法； 6. 6.显微注射法。显微注射法。 基因工程研究策略和实践39 五、重组体筛选、鉴定与五、重组体筛选、鉴定与 克隆扩增克隆扩增 基因工程研究策略和实践40 平板筛选平板筛选 插入失活插入失活 插入表达插入表达 电泳筛选电泳筛选 PCRPCR筛选筛选 核酸杂交核酸杂交 DNADNA测序测序 免疫学检测法免疫学检测法 1. 1. 常用筛选常用筛选/ /鉴定阳性重组体的方法鉴定阳性重组体的方法 初步初步筛选筛选 精确精确鉴定鉴定 表型表型鉴定鉴定 基因工程研究策略

27、和实践41 1.1.平板筛选法平板筛选法 （1 1）插入失活）插入失活（insertional inactivation)insertional inactivation)： 在载体在载体某个某个基因序列的限制性内切酶位点基因序列的限制性内切酶位点 上插入外源上插入外源DNADNA后，使该基因失去活性，从而不后，使该基因失去活性，从而不 能表达其相应的功能。能表达其相应的功能。 常以此现象作为标记，筛选被这种重组体常以此现象作为标记，筛选被这种重组体 转化的细胞。转化的细胞。 基因工程研究策略和实践42 基因工程研究策略和实践43 ( (插入失活法 插入失活法) ) 抗药性标记选择抗药性标记选

28、择 1. Amps Tets （转化失败）（转化失败） 2. Ampr Tetr （转化成功，但仅转入载体，无重组）（转化成功，但仅转入载体，无重组） 3. Ampr Tets （转化、重组均成功（转化、重组均成功 ） 基因工程研究策略和实践44 （2 2）插入表达（）插入表达（insertional expression)insertional expression) 载体设计时，在筛选标志基因前连接一段载体设计时，在筛选标志基因前连接一段 负调控序列（抑制作用），当目的基因在此插负调控序列（抑制作用），当目的基因在此插 入时入时 ，使其对下游的抑制作用丧失，使其对下游的抑制作用丧失 ，从而

29、下，从而下 游的筛选标志得到表达。游的筛选标志得到表达。 基因工程研究策略和实践45 CICI为负控制序列（抑制为负控制序列（抑制Ter表达）表达） 当当DNADNA插入使插入使CICI失活失活 Ter表达，表达， 由此作为阳性克隆的筛选。由此作为阳性克隆的筛选。 基因工程研究策略和实践46 2.2.酶切酶切- -电泳法筛选电泳法筛选 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养 后再抽提出重组质粒或重组噬菌体后再抽提出重组质粒或重组噬菌体DNA,DNA,用相用相 应的内切酶切割，应的内切酶切割，电泳电泳后后根据根据DNADNA分子大小分子大小 不同，鉴别真正重组体不同

30、，鉴别真正重组体DNADNA，排除假阳性，排除假阳性和和 载体自我连接载体双重体载体自我连接载体双重体。 该法不能鉴别插入片段大小相似的非目该法不能鉴别插入片段大小相似的非目 的基因片段的假阳性。的基因片段的假阳性。 基因工程研究策略和实践47 联合酶切联合酶切鉴定同源末端连接重组子中鉴定同源末端连接重组子中 DNADNA插入片段的方向插入片段的方向 基因工程研究策略和实践48 3 3. .PCR法筛选法筛选 提取重组质粒提取重组质粒DNADNA，用已知的特异引物扩，用已知的特异引物扩 增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应 电泳带。电泳带。 基因工程研究策略

31、和实践49 4 4. .核酸分子杂交（核酸分子杂交（hybridizationhybridization） 两条不同来源的含有互补核苷酸序列的单两条不同来源的含有互补核苷酸序列的单 链链核酸分子，通过碱基配对规律形成一个核酸分子，通过碱基配对规律形成一个 新的稳定的双新的稳定的双链链核酸分子的过程核酸分子的过程 u 菌落原位杂交（菌落原位杂交（Hybridization in SituHybridization in Situ） （以细菌为受体细胞）（以细菌为受体细胞） 使用与目的使用与目的DNADNA互补的探针鉴别阳性转化菌互补的探针鉴别阳性转化菌 基因工程研究策略和实践50 菌落原位杂交法

32、菌落原位杂交法 筛选筛选 复印至硝酸复印至硝酸 纤维素膜上纤维素膜上 用用NaOHNaOH菌体菌体 裂解裂解DNADNA变性变性 杂交杂交 放射自显影放射自显影 32P-cDNA 与放射性与放射性cDNAcDNA杂杂 交的菌落的斑点交的菌落的斑点 细菌菌落细菌菌落 单链单链DNADNA结结 合到膜上合到膜上 基因工程研究策略和实践51 5.5. DNA测序测序 测序：确定测序：确定DNA链上确切的碱基顺序链上确切的碱基顺序 方法：对初步筛选的阳性重组子，扩增后抽方法：对初步筛选的阳性重组子，扩增后抽提提 质粒，酶切回收片断，进行质粒，酶切回收片断，进行DNA测序确认测序确认。 6 6. .免疫

33、学检测法鉴定表达产物免疫学检测法鉴定表达产物 依据抗原、抗体特异性结合反应的原理，依据抗原、抗体特异性结合反应的原理， 以单克隆抗体对表达产物进行特异性检测。以单克隆抗体对表达产物进行特异性检测。 基因工程研究策略和实践52 六、目的六、目的DNADNA在受体细胞在受体细胞 中的表达中的表达 基因工程研究策略和实践53 基因工程表达系统基因工程表达系统 大肠杆菌系统大肠杆菌系统 枯草杆菌系统枯草杆菌系统 酵母细胞系统酵母细胞系统 昆虫细胞系统昆虫细胞系统 哺乳动物细胞系统哺乳动物细胞系统 原核表达系统原核表达系统真核表达系统真核表达系统 基因工程研究策略和实践54 基因工程基因工程操作的主要步

34、骤操作的主要步骤 载体载体 质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒 目的基因（外源基因）目的基因（外源基因） 基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成 PCR产物产物 限制酶消化限制酶消化 开环载体开环载体DNA目的基目的基 因因 连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化体外包装，转染体外包装，转染 带重组体的宿主带重组体的宿主 筛选筛选 表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交 基因工程研究策略和实践55 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结 分分 分离目的基因分离目的基因 切切 限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体 接接

35、拼接重组体拼接重组体 转转 转入受体菌转入受体菌 筛筛 筛选重组体筛选重组体 基因工程研究策略和实践56 基因工程的基因工程的实践实践 1.1.利用重组酵母生产乙肝疫苗利用重组酵母生产乙肝疫苗 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能生长，因乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能生长，因 此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜 上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高 的免疫原性，但其大规模生产受到病毒表面抗原来的免疫原性，但其大规模生产受到病毒表面抗原来 源的限制，而且提取物需要高度纯化，纯化过程中源的限制，而且提取物需要高度纯化，纯化过程中 往往会发生失活现象。此外，最终产品还必须严格往往会