原核表达载体

1、原核表达体系的构建刘华彬，董浚键、实验材料1）植物材料：拟南芥2）载体及菌株：克隆及测序用载体为 pMD18-T ，购自 Takara 公司。宿主菌 DH5。原核表达载体 （pET30c ？）。3）PCR 引物：登陆 GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设 计引物。4）药品试剂：反转录试剂盒（ TaKaRa），质粒小提试剂盒（ TIANGEN ），胶 回收试剂盒， Taq DNA 聚合酶（ TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切 酶（ TaKaRa），T4 连接酶（ TaKaRa），各种 DNA 和蛋白 marker，各种抗 生素类，、方法1）目的基因的获得（

2、 RT-PCR）：拟南芥叶片 mRNA 逆转录 cDNA PCR 基因（详见王希朝那份） ；PCR 产物用 0.8%琼脂糖凝胶分离。先设计好 PCR 的引物和 PCR的反应程序。2）克隆载体的构建：. 目的基因的切胶回收： 在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放 入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶 的体积。 计算凝胶重量（ 100 mg相当于 100 l），加入 3倍体积 solution DE-A， 75水浴 6-8 分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。 加入 2倍体积 solution DE-B ，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室 温

3、放置 1 min，12000 rpm离心 1 min。 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入 600 l Wash solution，室温 12000 rpm离心 30 s。 重复步骤一次。 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温 12000 rpm离心 1 min。 将吸附柱放入新的 1.5 mL 灭菌离心管中，在柱膜中央加入 30 l 75 预热的 ddH2O，室温放置 2 min，12000 rpm离心 1 min 。离心管中的液 体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于 -20备用。. 目的片断与克隆载体 pMD18-T 连接：pMD 19-T Simple Vector （ T 载

4、体，小纸盒子中）Insert DNAdH2OSolution I （冰中融化，小纸盒子中，跟 T 载体一起）1ul2ul2ul5ul5ul（等量）16 反应 30min. E. coli DH5 感受态细胞的制备： 将 E. coli DH5在 LB 平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接 种到 5 mL LB 培养基中， 37，200 r/min 振荡培养过夜。 将过夜培养的菌液 1 mL 加入到 100 mL LB 培养基中 （1: 100），培养2-3 h至 OD600=0.5，转入预冷的无菌离心管中，冰上放置 10 min，然 后于 4下 3000 rpm 离心 10 min。 弃去

5、上清，用预冷的 0.05 mol/L 的无菌 CaCl2 溶液 10 mL 轻轻悬浮 细胞，冰上放置 20 min，4下 3000 rpm离心 10 min。 弃去上清，加入 4 mL 预冷的含 15%甘油的 0.05 mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成 100 l 的小份，于冰上备用，或液氮速冻贮存于 -80。. 重组质粒转化 E. coli DH5（热击法）连接产物加至感受态 E.coli DH52（200ul）或（ 100ul） 【非连接载体 加 2ul 】 【加入后离火远点轻轻用手拨】冰上放置 20min42水浴热击

6、 90s立即放置冰上 2min（勿震荡）于超净工作台加 800ul LB 培养液37， 150rpm 预培养 50min6000rpm离心 1min，吸除 800ul 上清；剩余液体用来悬浮沉淀涂布 LB+Amp 平板上， 37倒置培养 12h（于超净工作台吹干液体） 。 . 挑取白色单克隆菌落，重悬于 5 l ddH2O 中，取其中 1 l 用于 PCR鉴 定。 PCR反应体系和反应程序同上面获取目的基因的 PCR 一样。 . 重组质粒的提取（ TIANGEN 质粒小提试剂盒，方法可以看试剂盒说明 书） 将以上剩余的 4 l 菌液接种到 5 mL 含 Amp 抗生素的 LB 液体培养基 中，

7、 37振荡培养过夜。 取 3 mL 菌液，室温 12000 rpm离心 1 min。 弃上清，加入 250 l Solution I ，重悬菌体细胞。 加入 250 l Solution，轻柔颠倒离心管 4-6 次。 加入 350 l Solution，轻柔颠倒离心管 6-8次，此时应出现白色絮状沉淀，室温 12000 rpm离心 10 min。 取上清（注意不要吸到蛋白） ，转入吸附柱，室温放置 1 min，12000 rpm 离心 1 min。 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入 500 l Wash Solution ，室温 12000 rpm离心 1 min。 重复步骤一次。 取下吸

8、附柱，倒掉收集管中的废液，室温 12000 rpm离心 1 min。 将吸附柱放入新的 1.5 mL 灭菌离心管中，在柱膜中央加入 60 l 75 预热的 ddH2O，室温放置 2 min ，12000 rpm离心 1 min。离心管中的 液体即为质粒。可立即使用或保存于 -20备用。. 重组质粒的酶切鉴定酶切反应体系、 反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。 酶切 产物用 0.8%琼脂糖凝胶分离。. 重组质粒的目的基因的序列测定重组质粒由测序公司测序。 . 菌种保存取 500l 重组菌液加入等体积 50%的无菌甘油 （ 终浓度达到 25%），液氮 速冻， -80保存。3）目的基因的原核

9、表达. 原核表达载体的构建 克隆载体的构建： 必须考虑使用的克隆载体有无多克隆位点， 没有就要 特别设计一对上下游引物， 分别带上酶切位点， 以便插入原核表达载体 上相应的多克隆位点。构建克隆载体的方法参见上面步骤。 重组质粒和表达载体的酶切： 酶切反应体系、 反应温度和反应时间根据 内切酶的种类确定设计。酶切产物用 0.8%琼脂糖凝胶分离。 回收表达载体酶切片断和目的基因酶切片断：i. 在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块， 放 入已称重的离心管中， 在保证目的基因全部回收的同时， 应尽量减少 胶的体积。ii. 计算凝胶重量（100 mg相当于 100 l ），加入 3倍

10、体积 solution DE-A， 75水浴 6-8 分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。iii. 加入 2 倍体积 solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中， 室温放置 1 min，12000 rpm离心 1 min。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入 600 l Wash solution，室 温 12000 rpm 离心 30 s。v. 重复步骤一次。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温 12000 rpm离心 1 min。vii. 将吸附柱放入新的 1.5 mL 灭菌离心管中，在柱膜中央加入 30 l 75预热的 ddH2O，室温放置 2 min

11、，12000 rpm离心 1 min。离心 管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20备用。 表达载体酶切大片断和目的基因的连接（根据连接酶说明书方法操作）连接反应体系反应液成分体积10T4 Buffer2.5 lddH2O15.5 lpET30c大片段2 lSTS(saIl/xhoI)4 lT4 Ligase1 lTotal25 l16过夜连接。 重组质粒转化 E. coli 宿主菌（根据表达载体确定） （热击法） 连接产物加至感受态 E.coli DH52（200ul）或（ 100ul） 【非连接载 体加 2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】冰上放置 20min42水浴热

12、击 90s立即放置冰上 2min（勿震荡）于超净工作台加 800ul LB 培养液37， 150rpm 预培养 50min6000rpm离心 1min，吸除 800ul 上清；剩余液体用来悬浮沉淀涂布 LB+Amp 平板上， 37倒置培养 12h（于超净工作台吹干液体） 转化菌的 PCR 鉴定（菌落 PCR） 转化菌的酶切鉴定：转化菌菌液扩大培养，提取质粒，双酶切检测。酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶 切产物用 0.8%琼脂糖凝胶分离。菌种保存取 500 l 重组菌液加入等体积 50%的无菌甘油 （终浓度达到 25%），液 氮速冻， -80保存。 . 目的基因在 E

13、. coli 表达载体宿主菌内的表达SDS-PAGE蛋白胶配制上层胶（ 3%）下层胶（ 12%）下层胶（10%） 下层胶 （7.5%）ddH2O1.085 mL1.5 mL1.85 mL2.25 mL上层胶缓冲液0.625 mL上层胶储备液0.75 mL下层胶缓冲液1.25 mL1.25 mL1.25 mL下层胶储备液2 mL1.65 mL1.25 mL20% SDS12.5 l25 l25 l25 l10%过硫酸铵(AP) 25 l50 l50 l50 lTEMED5 l7 l2 l7 lTotal 2.5 mL 5 mL 5 mL 5 mL在实验中，试用了不同浓度的下层胶，以获得最佳分离效

14、果。 IPTG诱导蛋白表达（ 这个不确定 ）i. 将重组菌在含对应抗生素的 LB 平板上划线培养过夜。ii. 次日，挑取单克隆，接种到 5 mL 含对应抗生素的 LB 液体培养基中， 37， 200 r/min 振荡培养过夜。iii. 将过夜培养的菌液 100 l 加入到 10 mL LB 培养基中 （1: 100）， 200 r/min 振荡培养 3 h 左右至 OD600=0.6。iv. 培养完毕后，取 1 mL 菌液 12000 rpm离心，弃上清， 200 l PBS悬 浮。在剩余 9 mL 菌液中加 100 mmol/L IPTG 54 l 至终浓度 0.6 mmol/L ，此时记为

15、 0 h。v. 此后分别在 1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，9 h 各取 1 mL 菌液，12000 rpm 离心，弃上清， 200 l PBS 重悬。加 2Loading buffer 后沸水 变性 5 min。vi. SDS-PAGE 检测蛋白表达。 检测重组蛋白可溶性（ 好像做多克隆抗体不用检测蛋白可溶性？ ）i. 将重组菌在含对应抗生素的 LB 平板上划线培养过夜。ii. 次日，挑取单克隆，接种到 5 mL 含对应抗生素的 LB 液体培养基中， 37， 200 r/min 振荡培养过夜。iii. 将过夜培养的菌液 100 l 加入到 10 mL LB 培养基中 (1: 100)， 200 r/min 振荡培养 3 h 左右至 OD600=0.6。iv. 加入 IPTG诱导至 6 h，4，10000 g离心 5 min。v. 去上