A细胞工程第4节—植物花粉和花药培养课件

1、A细胞工程第4节植物花粉和花药培养1 第五章 花药和花粉培养 大 大 家家 好好 ！ 植物组织培养植物组织培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养2 第五章第五章 花药和花粉培养花药和花粉培养 本章主要内容：本章主要内容： 花粉和花药培养的概念和应用花粉和花药培养的概念和应用 花粉小孢子发育途径花粉小孢子发育途径 花粉和花药培养方法花粉和花药培养方法 单倍体植株鉴定和染色体加倍单倍体植株鉴定和染色体加倍 第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养3 第一节第一节 花粉和花药培养的概念和应用花粉和花药培养的概念和应用 花粉和花药培养的概念花粉和花药培养的概念 花

2、药和花粉培养的历史花药和花粉培养的历史 花粉和花药培养的应用花粉和花药培养的应用 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养4 花粉和花药的培养花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂分化，分化， 由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。 第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养 单倍体植物单倍体植物( (haplobiont) ) 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个

3、完整的用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的 植株。植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精） 一、概念一、概念 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养5 第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养6 异同点异同点： 相同点相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细 胞，最后发育成单倍体植株。胞，最后发育成单倍体植株。 不同点不同点： 花药培养属器官培养，花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药 壁和药隔组织，以及雄性性

4、细胞的花粉粒壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒 花粉培养属细胞培养花粉培养属细胞培养: : 花粉培养没有药壁组织干扰；花粉培养没有药壁组织干扰； 可计数小孢子产胚率；可计数小孢子产胚率； 可观察雄核发育的全过程；可观察雄核发育的全过程； 单倍体产量高。单倍体产量高。 但技术更复杂，比花药培养难度大。但技术更复杂，比花药培养难度大。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养7 二、植物花药二、植物花药/ /花粉培养历史花粉培养历史 Guha和和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养曼陀罗花药培养 Nitsch 和和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养）烟草花粉培养

5、（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自 发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低） 80年代后期到年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子 培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续 成功成功Konz

6、ak (1999) 。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养8 通过通过 花药花药 培养培养 育成育成 的甜的甜 椒新椒新 品种品种 ： 海花海花 三号三号 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养9 三、花药和花粉培养的应用三、花药和花粉培养的应用 1)1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期； 第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养 供体植株供体植株 小孢子（小孢子（n） 花培花培 花粉植花粉植 株（株（n） 雄核发育雄核发育 自然加倍自然加倍 人工加倍人工加倍 纯合植株纯合植株DH （2n） 一年内获得纯系一年内获得纯系 常规育种需常规育种需4-

7、6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。 1、作物育种、作物育种 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养10 常规育种在杂交常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药代开始选择；花药 培养在培养在F1或或F2代进行培养，再人工加倍处代进行培养，再人工加倍处 理缩短育种周期理缩短育种周期3-5年年 克服后代分离，大大缩短育种周期克服后代分离，大大缩短育种周期 第二节第二节 花药和花粉培养的应用花药和花粉培养的应用 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养11 花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的 植株中选择某一种基因型的概率是植株中选择

8、某一种基因型的概率是(1/2)n，而，而 从常规杂交从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的代群体中，选择某一基因型的 概率为概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常，故单倍体育种的选择效率为常 规育种的规育种的2n倍。倍。 2) A细胞工程第4节植物花粉和花药培养12 例子例子： 二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBbAaBb，若要从后代中选择基因为，若要从后代中选择基因为AAbbAAbb 的纯合单株的纯合单株 常规方法常规方法： AAbbAAbb出现的概率为出现的概率为1/161/16，并且不能将，并且不能将AAbbAAbb与与AabbAabb、 aAbbaAbb区分

9、开。区分开。 AB aB Ab ab ABAABBAaBBAABbAaBb aBaABBaaBB aABb aaBb AbAabBAabBAAbbAabb abaAbBaabB aAbb aabb A细胞工程第4节植物花粉和花药培养13 例子例子： 二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择，若要从后代中选择 基因为基因为AAbb的纯合单株的纯合单株 单倍体方法：单倍体方法： AAbb出现的概率为出现的概率为1/4。 单倍体单倍体 二倍体二倍体 AB- - AABB aB- aaBB Ab- AAbb ab- - aabb 供体亲本供体亲本 AaBb 花培 从来源于

10、配子体的植株中选择某一种基因型的概率是从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是 (1/2)n，而从常规杂交，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率代群体中，选择某一基因型的概率 为为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。倍。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养14 3) 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代当代及时获及时获 得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系。得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养15 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植

11、可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植 物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确 定染色体组内是否存在同源染色体。定染色体组内是否存在同源染色体。 2、物种进化研究、物种进化研究 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养16 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，单倍体植株中基因不受显隐性的影响， 每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因 的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。 3、遗传分析 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养17 4、构建连锁图谱、构建连锁图谱

12、双单倍体双单倍体（DH）群体是永久性群体，群体是永久性群体， 能有效地用于遗传图谱的构建。能有效地用于遗传图谱的构建。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养18 能直接表达外源基因，不受显隐性影响能直接表达外源基因，不受显隐性影响 5、用于遗传转化、用于遗传转化 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养19 第二节第二节 花粉孢子体发育途径花粉孢子体发育途径 概念概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径） 花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝 分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把 花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫 雄核发育途径 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养20 一、花

13、粉发育的阶段一、花粉发育的阶段 花粉离体培养时，雄核发花粉离体培养时，雄核发 育最适宜的时期一般是育最适宜的时期一般是第第 一次有分裂或之前一次有分裂或之前。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养21 二、雄核发育途径二、雄核发育途径 1、A A途径途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营 养细胞和生殖细胞养细胞和生殖细胞 （1 1）A-VA-V途径途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2 2）A-GA-G途径途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3 3）A-VGA-VG途径（途径（E E途径）

14、途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独由营养细胞和生殖细胞各自独 立分裂，共同形成单倍体立分裂，共同形成单倍体 （4 4）C C途径途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多 倍体植株倍体植株 2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小 相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株， 或者核融合形成多倍体植株或者核融合形成多倍体植株 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养22 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养23 1、雄核发育与P花粉的形成 P-花粉：具

15、胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染花粉）或不染 色花粉（色花粉（NS-花粉）花粉） 2、雄核发育与饥饿处理 饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。 三、雄核发育启动机理三、雄核发育启动机理 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养24 1 1、胚状体发育途径、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2 2、愈伤组织发育途径、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产

16、生的植株会小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会 出现变异且倍性复杂。出现变异且倍性复杂。 四、花粉植株形态发生方式四、花粉植株形态发生方式 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养25 胚状体发育途径胚状体发育途径 部分花药通过胚状体途径形成小植株部分花药通过胚状体途径形成小植株 烟草花药培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养26 通过胚状体途径再生形成小植株通过胚状体途径再生形成小植株 烟草花药培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养27 胚状体发育途径胚状体发育途径 a) 球形胚 d) 鱼雷形胚 芸苔属小孢子培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养28 愈伤组织发育途

17、径愈伤组织发育途径 部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织 接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药 水稻花药培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养29 愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株 水稻花药培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养30 第三节第三节 花粉和花药培养方法花粉和花药培养方法 一、花药培养 二、花粉培养 三、白化苗现象 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养31 一、花药培养一、花药培养 1、取材、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜 的花蕾。的花蕾。 2、消毒、消毒 70

18、酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡酒精浸泡 30-60s后在后在1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在或在0.1的的 氯化汞溶液中消毒氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-5次次。 3、培养、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养， 至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形 成突出物（成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植周）；后转入分化培养基培养，形成小植 株株。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养32 二、花粉培养

19、二、花粉培养 (一一)花粉的分离与纯化花粉的分离与纯化 1、自然散落法、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉 自动散落后，收集培养。自动散落后，收集培养。 2、挤压法、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培 养。养。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养33 1）磁搅拌法磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； 2）超速旋切法超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎

20、花蕾、穗子、花药，通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药， 使小孢子游离出来（此法应用最广）。使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混对上述方法获得的小孢子混 合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 3、机械游离、机械游离 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养34 梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致） 30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体） A细胞工程第4节植物花粉和花药培养35 (二二)花粉培养方式花粉培养方式 1、平板培养、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。花粉置琼脂固化培养基上培

21、养。 2、液体培养、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通 气。气。 3、双层培养、双层培养 花粉置固体花粉置固体-液体双层培养基上培养。液体双层培养基上培养。 培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量 液体培养基。液体培养基。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养36 4、看护培养、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小 孢子发育。孢子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并用一块

22、活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并 使使 其生长和增殖。这个愈伤组织块称为其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织看护愈伤组织 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养37 1）在一个培养瓶中加入一定量厚）在一个培养瓶中加入一定量厚 的固体培养基，灭菌后备用。的固体培养基，灭菌后备用。 2）在无菌条件下，将一小块）在无菌条件下，将一小块 （1cm3）活跃生长的愈伤组织）活跃生长的愈伤组织 接种到培养基上，再在愈伤组接种到培养基上，再在愈伤组 织块上放一片（织块上放一片（1cm）已灭菌）已灭菌 的滤纸，放置过夜。的滤纸，放置过夜。 3）将分离的）将分离的花粉接种到已经充分花粉接种到已经充分 吸收

23、愈伤组织渗透液的滤纸上。吸收愈伤组织渗透液的滤纸上。 4）单细胞分裂形成肉眼可见的小单细胞分裂形成肉眼可见的小 细胞团后，即转移到新鲜培养细胞团后，即转移到新鲜培养 基上培养，基上培养，恒温培养，恒温培养，得到单得到单 细胞无性系。细胞无性系。 具体方法具体方法 2. A细胞工程第4节植物花粉和花药培养38 看护培养图解 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养39 5、微室培养、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培 养。养。 6、条件培养基培养、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物利用培养过花药的液体培养基或含失

24、活花药提取物 的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养40 微室培养图示：微室培养图示： 1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油 旁边各加石蜡油旁边各加石蜡油 盖盖玻片盖盖玻片 盖盖玻片盖盖玻片 平视图平视图 凹穴载玻片凹穴载玻片 置培养皿中置培养皿中2628 恒恒 温培养温培养 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养41 花粉培养过程花粉培养过程 取花蕾（镜检）取花蕾（镜检） 预培养数天预培养数天 取花药取花药 消毒消毒 分离花粉分离花粉 第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技

25、术 接种接种培养培养 愈伤组织发生愈伤组织发生 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养42 三、白化苗现象三、白化苗现象 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养43 （一）白化苗产生的影响因素及机理（一）白化苗产生的影响因素及机理 1 1、内因、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、 花粉发育时期。 2 2、外因、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养 条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3 3、机理、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生 白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养44 （二）白化苗的控制（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、

26、预处理、培养基成分等因素进行通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。调控。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养45 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 （一）基因型（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素 之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反 应差异较大。应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养46 小孢子发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。

27、对诱导雄核发育非常重要。 （三）花粉发育时期（三）花粉发育时期 适宜时期适宜时期：单核期：单核期,尤其是单核中、晚期尤其是单核中、晚期 (单核靠边期单核靠边期) A细胞工程第4节植物花粉和花药培养47 芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产 胚率比较 Topas 10,000-200,000 1-20 Westar 1000-10,000 0.1-1 Delta 100-10,000 0.01-1 Bounty 10-100 0.001-0.01 基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%） A细胞工程第4节植物花粉和花药培养48 1 1、植株生长条件、植株生长条件 光温等

28、因素均能影响花药培养力。一光温等因素均能影响花药培养力。一 般般 处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差 异。异。 2 2、植株生长时期、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。一般是开花始期优于开花末期。 3 3、P P花粉的频率花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生不同温度、日照时数、氮饥饿及生 长物质处理提高长物质处理提高P花粉的数量花粉的数量 （二）供体植株生长条件和生理状态（二）供体植株生长条件和生理状态 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养49 随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位

29、置推 向一边，即单核靠边期。向一边，即单核靠边期。 雄配子体的发育雄配子体的发育 营养细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞精子精子 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养50 四分体四分体: 醋酸洋红染色醋酸洋红染色 四分体四分体: Alexanders 染色染色 单核期单核期双核期双核期 成熟花粉粒成熟花粉粒 处于不同发育时期的烟草小孢子处于不同发育时期的烟草小孢子 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养51 单核晚期单核晚期 液泡液泡 第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后期 双核早期双核早期 双核中期双核中期 生殖核生殖核 生殖核生殖核 营养核营养核 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养52 一般而言，单核期

30、（第一次一般而言，单核期（第一次 有丝分裂前）对诱导反应最有丝分裂前）对诱导反应最 敏感，为最佳培养期。敏感，为最佳培养期。 形成双核后，在合适的条件形成双核后，在合适的条件 ，主要由营养细胞分裂产生，主要由营养细胞分裂产生 胚状体。胚状体。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养53 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期发育时期物种物种 减数分裂期减数分裂期草莓、番茄草莓、番茄 四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄 单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄

31、子、青椒、小麦 单核早期至晚期单核早期至晚期烟草烟草 单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝 四分孢子期至双核四分孢子期至双核 期期 玉米玉米 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养54 l对不同发育阶段的花药对不同发育阶段的花药 进行培养测试进行培养测试 l确定最佳小孢子发育时确定最佳小孢子发育时 期的形态特征期的形态特征 l注意形态特征会因品种、注意形态特征会因品种、 发育状态、环境条件的发育状态、环境条件的 变化而发生变化变化而发生变化 处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定花粉发育时期的确定 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养55 单

32、核期的确定单核期的确定： 根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始 积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用 醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定 花粉的发育时期。花粉的发育时期。 但是接种前不可能把所有的花粉都进行一但是接种前不可能把所有的花粉都进行一 次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小 与花粉发育年龄的相关性，实际操作中取一定与花粉发育年龄的相关性，实际操作中取一定 大小的花蕾进行的大小的花蕾进行的。 A细胞工程第4节植物花粉和花

33、药培养56 A.A.通过显微镜下观察确定小孢子发育时期通过显微镜下观察确定小孢子发育时期 醋酸洋红染色 DAPI 染色 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养57 B.B.通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期 花蕾的外部形态特征与小孢子的发育时期有花蕾的外部形态特征与小孢子的发育时期有 一定的相关性，花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作一定的相关性，花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作 为判断小孢子发育时期的基本指标。为判断小孢子发育时期的基本指标。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养58 预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：预处理

34、目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的 小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具 胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大 量增加。量增加。 预处理方法预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括主要是对花药进行适度的逆境处理，包括 低温、高温、化学物质、离心、射线等。低温、高温、化学物质、离心、射线等。 （四）预处理（四）预处理 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养59 1 1、高低温处理、高低温处理 低温冷藏低温冷藏是最是最常用的

35、方法常用的方法 从健壮无病植株采集花蕾，将花蕾用湿纱布包裹放入塑料袋中，置冰箱 冷藏。低温处理可阻止小孢子正常分化，使停留于单核状态的花粉显著增多， 有利于诱导分化愈伤组织和胚状体。 例子例子: : 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.394.39个，个，6-96-9处处 理理1 1天，产胚数提高到天，产胚数提高到61.461.4个，预处理个，预处理4 4天后，胚状体产量降为天后，胚状体产量降为10.4710.47个。个。 预处理方法：预处理方法： A细胞工程第4节植物花粉和花药培养60 高温处理（热击处理）：高温处理（热击处理）： 指花

36、药接种后，先在较高温度下（指花药接种后，先在较高温度下（30-3530-35）培养数天，然后再移至）培养数天，然后再移至 正常温度下继续培养。正常温度下继续培养。 例子例子: :如烟草，如烟草，3232高温；小麦，高温；小麦，3333高温预处理显著地提高了小孢高温预处理显著地提高了小孢 子胚胎发生能力（子胚胎发生能力（TouraevTouraev，19961996） A细胞工程第4节植物花粉和花药培养61 2 2、化学物质处理、化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能 维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造

37、成小孢子营养饥饿，维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿， 从而使小孢子去分化从而使小孢子去分化。 3 3、其它、其它 l包括包括射线、离心、磁场等射线、离心、磁场等。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养62 （五）培养基（五）培养基 1.1.基本培养基基本培养基 主要为主要为N6和和MS培养基。培养基。 MS和和H培养基：培养基：适合双子叶植物花药培养；适合双子叶植物花药培养； B5培养基：培养基：适合豆科和十字花科花药培养；适合豆科和十字花科花药培养； N6培养基：培养基：适合禾谷类作物的花药培养。适合禾谷类作物的花药培养。 Nitsch培养基培养基:适合芸薹属和曼陀罗属

38、。适合芸薹属和曼陀罗属。 高浓度的高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。显著抑制花粉愈伤组织形成。 铁盐铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养63 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。 u不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。 在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。 u一般认为一般认为单子叶植物单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。比双子叶植物需糖的浓度要高。 u玉米中

39、蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。 u较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。 2.2.碳源碳源 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养64 3 3、激素、激素 细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗 4 4、氨基酸、氨基酸 5 5、活性碳、活性碳 6 6、pHpH A细胞工程第4节植物花粉和花药培养65 （六）培养条件（六）培养条件 1 1、温度、温度 物种间有差异，物种间有差异，培养温度在培养温度在2528左右左右 2

40、2、光照、光照 光暗交替培养，每天光暗交替培养，每天1218h的光照，光照强度的光照，光照强度 200010000lx。 3 3、植板密度、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到到 2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相 对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分 裂的空间，从则有利于胚状体发生。裂的空间，从则有利于胚状体发生。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养66 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用

41、。花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。 但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。 （七）花药壁因素（七）花药壁因素 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养67 第四节第四节 单倍体植株鉴定和染色体加倍单倍体植株鉴定和染色体加倍 一、倍性鉴定一、倍性鉴定 二、染色体加倍二、染色体加倍 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养68 一、倍性鉴定一、倍性鉴定 （为什么要进行倍性鉴定？）（为什么要进行倍性鉴定？） 1 1、染色体直接计数法、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体 数目。 2 2、间接鉴定、间接鉴定 （

42、1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中 DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及 保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长， 花粉粒小，不结实。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养69 （4 4）杂交鉴定法）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情 况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5 5）分子标记鉴定）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记） 和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等） A细胞工程第4节植

43、物花粉和花药培养70 二、染色体加倍二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？）（为什么要进行加倍？） 1.自然加倍自然加倍: : 花粉细胞核有丝分裂或核融合可自然加倍，其优点是不会花粉细胞核有丝分裂或核融合可自然加倍，其优点是不会 出现畸形，缺点是随机性强，难以掌握和利用出现畸形，缺点是随机性强，难以掌握和利用。 2.人工加倍：人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%0.4%秋水仙素秋水仙素 的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。 3.愈伤组织反复继代培养，可

44、得到二倍体植株。愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。 将单倍体植株（孢子体）的茎段、叶柄、根茎切下，置适宜的培养将单倍体植株（孢子体）的茎段、叶柄、根茎切下，置适宜的培养 基上使之发生愈伤组织，反复继代后再将愈伤组织转移到分化培养基上，基上使之发生愈伤组织，反复继代后再将愈伤组织转移到分化培养基上， 即可获得较多二倍体植株。即可获得较多二倍体植株。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定 高高频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植 株株。 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养

45、71 第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术 单倍体植物天然发生的途径：单倍体植物天然发生的途径： 孤雌生孤雌生殖殖 孤雄生孤雄生殖殖 无配子生无配子生殖殖 也称单性生殖，即卵不经过受精也能 发育成正常的新个体 配子体可以不经过配子的结合，而 直接产生孢子体的，这种现象叫做 无配子生殖 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养72 花药和花粉培养基本流程：花药和花粉培养基本流程： 预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境） 收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株。形成小植株。 选择合适的供体植株（选择合适的供体植株（F1？）？） 倍性鉴定或染色体加倍 A细胞工程第4节植物花粉和花药培养73 花药培养脱毒花药培养脱毒 19741974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期花药采取时期 单核期：花蕾单核期：花蕾4-64-6mmmm，花药花药1 1mmmm 花药诱导愈伤组织培养基花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+M