血清清蛋白_γ-球蛋白的分离纯化与定量----薛彪裴婕

1、血清清蛋白、-球蛋白的分离与纯化与定量实验设计南方医科大学 公共卫生与热带医学学院学院10级预防医学（食品安全）学号：姓名：薛彪学号：姓名：裴婕 日期：2011年10月19日摘 要 健康人或动物血清中含有丰富的血清清蛋白，1-球蛋白，2-球蛋白，-球蛋白，-球蛋白等。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白量的50%以上，是维持血液渗透压的重要物质。血清清蛋白还是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。-球蛋白又称免疫球蛋白，在血清蛋白质中数量居第三，具有重要的一用价值。各种血清蛋白的功能，

2、性质，结构有所不同。因此不同蛋白质的分子量、溶解度、在一定的带电情况等都有所不同，本试验就是利用各种蛋白质的差别 ，实现蛋白质的分离、纯化与定量。关键词：血清清蛋白 -球蛋白 蛋白质的差别 分离与纯化目 录1 前言22 实验目的33 实验原理44 实验器材与试剂55 实验步骤66 结果及计算137 实验预期及可行性评估148 注意事项159 参考文献1. 前言 血清蛋白是血浆里最丰富的蛋白质。每一个蛋白分子能携带七个脂肪酸分子。这 血清蛋白模型些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子。血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子。尤其是血清蛋白，能够携带

3、着许多药物分子，比如布洛芬。 正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且如此容易地被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一。今天，当需要一种蛋白质时，一种来源于牛体内的类似的蛋白在研究中被广泛地使用，这种蛋白叫做牛族血清蛋白或者称作BSA。许多酶在稀溶液中不稳定，解决的办法是加入一些牛族血清蛋白。在试验中它能使酶稳定，且相对地中性,不会影响酶的性质。而-球蛋白在血清蛋白质中的总含量也达到了第三位，在医学和临床上有着重要的意义。2. 实验目的：2.1 从血清中分离并纯化血清清蛋白和-球蛋白。2.2 进行血清清蛋白和-球蛋白的纯度鉴定。2.3 进行血清清蛋白和-球蛋白的定量测定。 3实验原理：

4、3.1 粗提取（盐析法）在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性，而使蛋白质从水溶液中沉淀出成为盐析。蛋白质表面的电荷和水化膜是维持蛋白质亲水胶体特性的两个重要因素，当其中一个受到破坏，都会降低胶体的稳定性，使蛋白质分子凝聚而发生沉淀，从而达到盐析的目的。而各种蛋白质的颗粒大小所带电荷、亲水性都不同，盐析所需的最低盐浓度也各不相同，因此可以利用不同浓度的盐溶液分别析出各种蛋白质，从而达到蛋白质初步的分离。3. 2脱盐 用盐析法分离的得蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须首先去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等，本试验采用的是凝胶层析法，利用得失蛋白质与无机盐之

5、间分子量的差异，当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径达的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔而析出，小分子的则滞留在凝胶颗粒中而后洗脱出来。3.3 纯化 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。 本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以

6、通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。3.4 纯度鉴定欲检测用上述方法分离的清蛋白和-球蛋白是否纯净，单一，可采用醋酸纤维素薄膜电泳对其进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和-球蛋白的纯度。正常人的血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可得5条区带，本法纯化后的伽玛球蛋白在醋酸纤维电泳图谱上，仅在清蛋白和伽玛球蛋白位置上出现。3.5 定量测定清蛋白，-球蛋白的定量测定可采用多种方法，如紫外吸收发，本实验采用双缩脲发。 凡是具有两个或两个以上肽键的化合物，都可以在碱性溶液中与Cu2+形成紫色复合物，即为双缩脲反应，此化合物颜色的深浅与该化合物的浓

7、度成正比，在54nm处有最大吸收峰。蛋白质有多个肽键，因此具有双缩尿反应，故可以用分光光度法来测定蛋白质的浓度。4. 实验器材与试剂4.1实验材料和试剂4.1.1 0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.2 0.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.3 0.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.4 1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液4.1.5 饱和的硫酸铵溶液4.1.6 0.92mol/l磺基水杨酸4.1.7 0.05mol/lBaCl溶液4.1.8 双缩脲试剂4.1.9 蛋白质标准4.1.10 健康人的血清或动物血清4.2 仪器及器材： 1.层析

8、住2.烧杯3.吸管4.滴灌5.试管6.黑色反应板7.贴固定架8.螺旋夹9.离心管和离心机10.分光光度计 和水浴箱4.3 试剂的配制：4.3.1 0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸按23.12g，加蒸馏水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均匀），调节PH至6.5后，加蒸馏水至1000ml。4.3.2 0.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做5倍稀释。4.3.3 0.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做3倍稀释。 注意：上述三种溶液的PH必须准确，用蒸馏水稀释后营再测PH。由于醋酸铵可遇热分解，故配置溶液时不得加热，配好后必须密

9、封保存，以防PH和浓度发生改变，否则将影响分离蛋白质的纯度。4.3.4 1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液：称取NaCl87.7g溶于0.3mol/LPH6.5的醋酸铵溶液中至1000ml。4.3.5饱和的硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000ml蒸馏水中，在7080摄氏度下搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。4.3.6 0.92mol/l磺基水杨酸4.3.7 0.05mol/lBaCl溶液4.3.8 双缩脲试剂：精确称取硫酸铜3.0g、酒石酸钾钠9.0g及碘化钾5.0g，各自分别溶于25ml蒸馏水中。将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入

10、1000ml容量瓶中，加入6.0mol/L氢氧化钠100ml，混匀。再加入硫酸铜溶液，边加边摇，最后加水定容至1000ml，储存于塑料瓶内。此试剂可长期保存，有储存瓶内有黑色沉淀出现，则需重新配置。4.3.9蛋白质标准：用微量凯氏定氮法准确测出牛血清清蛋白或酷蛋白的蛋白含量，然后用15%氯化钠-麝香草酚溶液稀释成梅1ml蛋白质含量为6.0mg，此蛋白质标准液4摄氏度可保存八个月。4.3.10 0.9%氯化钠溶液。5.实验步骤5.1葡萄糖电泳层析柱的准备 （1萄糖层析柱的准备步骤）步骤操作（1）凝胶的准备称取干燥葡萄糖凝胶G-25，按每克干胶假加入蒸馏水约50ml。置于沸水浴中1h，取出冷却，待

11、凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液， 然后重复处理两次，加入两倍量的0.02mol/l,PH6.5 NH4AC缓冲溶液，轻轻搅拌，静止片刻待凝胶颗粒沉降后，倾去上层液（2）装柱选用内径1.0cm，高10cm，顶部嵌装有砂芯滤片的层析柱，夹持在支架上，并保持垂直。首先向柱内加入少量的缓冲溶液，将上述处理的过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度（约为7cm）为止。 装柱后接上恒压储液瓶，或在柱下端流出口软管上加螺旋夹，调节流速约为2ml/min用 缓冲溶液，洗涤平衡胶柱，然后夹死下端流出口，装柱操作即完成，可供蛋白质样品液除盐使用。（3）凝胶的再生及保存此凝胶层析柱可以反复使用，每

12、次使用后应该一以所需缓冲液，流洗平衡即再生平衡，如暂不使用，应以含3mmmol/lNaN3 d 缓冲液洗涤后放置，防止凝胶霉变，久不使用宜将其由柱内倒出，加入NaN3至3mmol/l,湿态保存于4度的冰箱注意：a.沸水浴过程中要经常摇动，使气泡逸出。b.装柱时注意凝胶粒混合均匀，凝胶床内不得有界面和气体，凝胶床面平整。C.若凝胶床内出现界面、气泡或流速明显减慢时，将胶粒倒出，重新装柱。D.久用后，如凝胶床表面有沉淀等杂质滞留，可将表面一层胶粒析出，再填补新的凝胶。e.凝胶禁止保存于0摄氏度以下冰箱中，防止冻损胶粒。5.2 DEAE纤维素离子交换层析柱的准备（2DEAE纤维素离子交换层析柱的准备

13、的步骤）步骤操作（1）酸碱处理按100ml柱床体积称取DEAE纤维素14g，加入0.5mol/L的盐酸，搅拌均匀，放置30min后加约10倍量的蒸馏水，搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，弃去含细微悬浮物的上层液。如此反复洗涤23次后，置垫有细尼龙滤布的布氏漏斗中抽滤。用蒸馏水充分虑洗，直至流出液PH值约为4 然后将DEAE纤维素置于烧杯中，加入0.mol/L的氢氧化钠处理一次。并以蒸馏水充分虑洗，直至流出液PH值约为7（2）装柱，平衡经酸碱处理过的DEAE纤维素置于烧杯中，加入0.02mol/L，PH约为6.5 的醋酸铵缓冲液，并用醋酸调节PH至6.5，倾去上层清夜，用此DEAE纤维素装柱。 在

14、层析柱下端出水口套上硅胶管，用螺旋夹拧紧，然后将上述处理好的的纤维素悬液倾入柱内，再拧松螺旋夹，使液体流出，直至所需的柱床高度约为6厘米为止。待液面接近纤维柱柱床表面。将螺旋夹拧紧， 装柱后层析柱接上恒压储液瓶，用0.02mol/L,PH 约为6.5 醋酸铵缓冲液流洗平衡。，（3）再生及保存DEAE纤维素柱用过一次后，经1.5mol/L的氯化钠-0.3mol/L的醋酸铵缓冲液流洗。再用0.02mol/L PH为6.5醋酸铵缓冲液洗涤平衡后可重复使用。 如暂不使用，应以湿态保存在含0.11mol/L正丁醇的缓冲液中，以防霉变。注意：a.HCl处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质。b.装柱时要

15、注意装均匀，纤维素柱床内不得有界面和气泡，表面要平整。c.若柱床顶部有洗脱不下来的杂质，应将顶层纤维素吸弃，填补新的、经酸碱处理过的DEAE纤维素，并用缓冲液洗至平衡。d.多次使用后如杂质较多或流速过慢，可将纤维素倒出，先用1.52.0mol/NaCl浸泡，水洗，再重新装柱。5.3中性盐沉淀步骤步骤操作（1）盐析取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用（2）溶解沉淀向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化球蛋白用注意

16、：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。5.4过凝胶层析柱步骤步骤操作（1）调节层析柱液面葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面（2）加样品用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止（3）洗层析柱小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液（4）洗脱待样品液进入凝胶床内，继续

17、用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量（5）检测及收集蛋白质 在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析(6)层析柱再生平衡

18、收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤23ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避

19、免损耗，严禁倒掉。5.5 球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱步骤 操作（1）调节层析柱换冲液面经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。（2）加样品将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止。（3）析层析小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液。（4）洗脱待样品进入纤维素柱床内，继续用0.02mol/L PH 6.5的醋酸

20、铵缓冲液流洗，。同时注意流出液量（5）检测及收集蛋白质流洗时，随时用0.92mol/L磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时，立即连续收集三管，每管10滴，。此不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的-球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。 注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切

21、勿使蛋白质峰溶液流失，特别是收集伽马球蛋白时。6 清蛋白的纯化，过DEAE纤维素阴离子交换层析柱 （清蛋白的纯化，过DEAE纤维素阴离子交换层析柱的操作步骤）步骤 操作（1）调节层析柱缓冲液面此时DEAE纤维素层析柱不必再生，可直接用于纯化清蛋白小心控制住下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面，柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体流出量（2）加样品将除盐后收集的清蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹，使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止 （3）洗层析柱将除盐的粗制清蛋白溶液上柱后，改到0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱小

22、心用1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液（4）洗脱待样品进入纤维素柱床内，继续用0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗。同时注意流出液量。流出约6ml（其中含-球蛋白及-球蛋白）后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素表面平齐。改用0.3mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱（5）检测及收集蛋白质用0.92mol/L（20%）磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质（方法同前）。由于纯化的清蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可见一层浅黄色的成分被0.3mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱下来，大约改用0.3mol/L NH4AC

23、缓冲液洗脱约2.5ml时，即可在流出液中试出有蛋白质出现，立即连续收集2管，每管10滴，此即为纯化的清蛋白液，留作纯度鉴定用（6）纤维素层析住的再生与平衡用过的DEAE纤维素层析柱，应重新再生平衡先用约6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用0.02mol/L pH6.5 NH4AC液约10ml流洗平衡即可注意：a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时，不要是液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.使用时切勿将各时段所用的溶液浓度搞混。d.洗脱是

24、应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。7 纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）步骤 操作准备电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在同一水平a，页面与支架距离22.5cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥薄膜准备：将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镊子青青取出，粗面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。点样薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片一段的截面在盛有样品的直接沾取23微升待测品，让后将样品与薄膜点样先轻轻接触，均匀分

25、布在点样线上，带样品渗入薄膜后移开，四种样品分别点样。电泳将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。平衡约5min，使缓冲液渗透大道平衡。接好电路，调节电压开始电泳。待各个样品没有变化停止电泳，并轻轻取出。染色漂洗和鉴定将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约5min。后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况得出结论。5.8 定量测定（双缩脲法）步骤 操作反应体系设置取血清0.1ml，加0.9%氯化钠溶液0.9ml 混匀（1:10稀释），作为测定管1，清蛋白作为测定管2，球蛋白作为测定管3取五支试管编号，按下表加入试剂，混匀

26、试剂 空白管 标准管 测定管1 231:10稀释血清 0 0 1.0清蛋白液 0 0 0 伽马球蛋白液 0 0 0蛋白质标准液 0 1.0 0 0 0.9%氯化钠 2.0 1.0 1.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 0 1.0 0 0 1.0 4.0 0 0 1.0 0 1.0 4.0反应混匀后置37摄氏度水域中保温20min比色测定以空白管调零点，在540nm波长处比色，读取各管吸光值A注意：每管重复测三次A值求平均值用于蛋白质浓度计算。6、结果及计算6.1 定性鉴定结果 将3条经染色的纤维醋酸薄膜并列，使样点线位于同一水平，以正常血清蛋白谱作为对照，观察提纯物质属于那种蛋白质，其纯

27、度如何。并描述与正常带相比的位置及条带数。图谱见实验结果。6.2 数据记录测定次数 标准管 测定管1 测定管2 测定管3123各管平均值A6.3 结果计算按以下三式计算各管蛋白质浓度 （蛋白质含量单位mg/ml） 血清蛋白质=AU1/As*6.0*10 清蛋白= AU2/As*6.0 伽马球蛋白= AU3/As*6.06.4 常见问题及分析问题解析醋酸纤维薄膜出现白斑或弯曲薄膜质量不好，电泳槽密闭性不好或电流太大，温度过高导致过分干燥电泳图谱不整齐点样不均匀，薄膜未完全浸透，温度过高使薄膜局部干燥，电泳时薄膜未方正，电流方向与薄膜方向不平衡，缓冲液变质。染色后白蛋白部分着色浅染色时间不足，染色液陈旧，蛋白质含量过高各组分分离不佳点样过多，薄膜结构过分细腻，透水性、导电性差，电流过小薄膜上有气泡贴膜时有气泡，玻璃板上有油脂