生物化学实验-凝胶过滤层析

1、实验十 凝胶过滤柱层析纯化 碱性磷酸酶 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与 方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。 内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0 Kd=1 0Kd1 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂

2、糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖 凝胶 G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200 吸水量 （g/g干凝 胶） 1.01.52.55.07.510.015.020.0 工作范围 （肽与蛋 白）D 700150050001500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000 凝胶及柱的选择 凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压。 装柱的

3、两种方法： a.手工操作 1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床打开出水口连续缓慢 加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9） 样品上柱 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的1020% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定 三、仪器的使用核酸蛋白检测仪及 部分收集器的操作方法 核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法 1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪 三部份电路连接是否正确，插上电源插头。 2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指 示灯亮。可

4、根据需要调换不同的走纸速度。记录仪 量程调在10mV档上。 3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程 旋钮拔到100T档。 4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录 仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量” 旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数 字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时 左右，待基线平直后，可加样测试。 5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析 柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光 密度A要调零，量程开关拔到100T，调节光量旋 钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光 率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节

5、A调 零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录 仪零位旋纽使记录仪指示在0位 。 6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当 样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪 给出所需样品吸收的图谱。 7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池 和尼龙管。 记录仪光吸收A读数 当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应 于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定 在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当 记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为 0.25A。 数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式) 当A量程开关选定在0-1.0A档时，此

6、时数显板上显示 和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示 为0.80A。 当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收 A读数为: A量程选定在0-2.0档时，数显读数2=实际光吸收读数 A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数1=实际光吸收读数 A 部分收集器的操作方法 1将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开慢 和“定”，再按一下停设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。 2定位， 将“顺

7、/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手 动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报 警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管 (在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在 “逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管 口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使 滴臂口对准第一根试管即可。 移液器（俗称移液器（俗称“枪枪”）的使用：）的使用： 四、操作方法 （一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择 选择Sephadex G100和1.5cm60cm的柱子。 2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水 或洗脱液中充分溶胀

8、，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻 出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在 沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达 到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 （二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱 容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连 续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后， 打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集， 待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱， 关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在

9、凝胶 表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝 胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 （四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪。柱出水 口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液 口再与自动部分收集器相连。核酸蛋白检测仪的量程置 于2A，记录仪量程置于10mV，走纸速度设定 0.5mm/min。 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至 与胶面相切。沿管壁将碱性磷酸酶样品溶液2mL小心加 到凝胶床面上，应避免将柱床面凝胶冲起，打开下口夹 子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶 液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用 1mL洗脱液冲

10、洗管壁2次。最后凝胶上方加满洗脱液， 旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通洗脱瓶。上样和洗脱的 流速为0.3mL/min左右。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.01mol/LTris-HCl洗 脱，用自动部分收集器收集流出液，每管2mL 。 (六）碱性磷酸酶活力峰收集 对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力测定， 收集碱性磷酸酶活力峰，即为经凝胶过滤柱层析纯 化的洗脱液。对合并后的碱性磷酸酶活力峰进行酶 活和蛋白浓度的测定，即可得到其比活力。 五、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的 操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水