X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构

1、蛋白质结构测定 2011-3- 30 蛋白质三维结构测定方法及数量 蛋白质三维结构测定年增长图 第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定 原理 基本过程 优缺点 应用实例 一、相关原理 光的衍射现象 X射线的发现及应用 本质的争论 X射线衍射的发现 晶体学基础知识 X射线晶体衍射 ?S 光线拐弯了！ 1.1.光的衍射现象 E S E S 当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就 发生明显的衍射现象如果缝很宽，其宽度远大于波 长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象 就很不明显了 惠更斯菲涅耳原理 菲涅耳补充：从同 一波阵面上各点发 出的子波是相干波。 1818年 惠更斯：光波

2、阵面 上每一点都可以看 作新的子波源，以 后任意时刻，这些 子波的包迹就是该 时刻的波阵面。 1690年 解释不了光强分布！ 2. X射线的发现历程及应用 失之交臂 1836 法拉第 发现阴极射线 1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干 版和光片有问题？ 1890 古德斯柏德 洗出了一张X射线的透视底片 照 片的冲洗药水或冲洗技术 发现X射线 本质的争论 X射线衍射 2.X射线的发现及应用 1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。 伦琴夫人的手的X射线照片 X射线在医学上的应用 伦琴的新发现轰动了全世界, 不到三个月, 维也纳的一 家医院便拍出了应用于医疗的X射线

3、照片.从此, X射线 拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。 为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。 1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重 建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也 就是已被广泛应用的CT。 X射线与诺贝尔奖物理学奖 伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 1903 年诺贝尔物理学奖。 1906 年的诺贝尔物理学奖。 劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。 英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。 英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。 瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物

4、理学奖。 美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。 前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖; 美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖; 瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。 化学奖 荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。 美国著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。 英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。 英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。 美国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。 英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖; 美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖

5、; 1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。 3.X射线本质的争论 X射线本质的争论-波动说 巴克拉： X射线波动性 标识谱线：不管元素已化合成什么化合物， 它们总是发射一种硬度的X射线，当原子量 增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。 这说明X射线具有标识特定元素的特性。 X射线本质的争论微粒说 X射线微粒论者 粒子具有旋转性 布拉克父 子 4.X射线衍射 X射线衍射的获得 波长范围：100.1埃 欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格 常数恰是这样的线度 衍射波的两个基本特征衍射线（束）在空间分布的方位（衍 射方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切

6、相关。 X射线晶体结构分析？ 使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为 物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结构作为 研究结果的一种分析方法。 5.X射线的获得： X射线管激光等离子体 同步辐射 X射线激光 6.晶体基础 什么是晶体 晶体的周期排布 晶体的对称性 3.1什么是晶体 固体物质 晶体 相当罕见的东西？ 非晶体 晶体(Crystal ) 指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性 重复排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。 晶体什么样（1） 晶体什么样（2） 晶体什么样（3） 晶体什么样（4） 2.晶体和点阵结构 晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成“点 阵”来研究. 一维周

7、期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵 三维周期性结构与空间点阵 一维周期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵 三维周期性结构与空间点阵 晶胞(Unit cell) 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 选择平行六面体的原则： 所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 所选平行六面体之体积应最小。 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间 距小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行 六面体。 单位平行六面体，a、b

8、、c 、 、 、 是表征它本身形状、 大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。 c a b 单位平行六面体参数 单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角坐标轴之间交角。 a、b、c 轴单位。 a、b、c、 、 、 关系有七种情况，与单位平行六面体七种格 子相对应。 a=b=c = = =90o a=b=c = = 90o， 60， 109o2816 a=b c = = =90o a=bc = =90o =120o a b c = = =90o a b c = =90o 90o a b c 90o 按结点位置，可有四种不同的类型： P 原始格子（角顶） C 底心格子（角顶、顶底面） I 体心格子（角

9、顶、体心） F 面心格子（角顶、每个面） P 原始格子（角顶） C 底心格子（角顶、顶底面） I 体心格子（角顶、体心） F 面心格子（角顶、每个面） 结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说， 格子的种类有、且只有十四种。 衍射方向 二、X射线晶体结构测定基本过 程 蛋白质获取（提纯） 晶体生长并经冷冻技术处理 重原子衍生物制备 衍射数据收集 衍生数据分析和改进 结构模型的获取（包括修正） （2）晶体生长过程及影响因素 晶核（尽量少） 微晶（可用作晶种） 晶体在数小时至数月后出现 2个问题： 是盐晶吗？ 能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶） 影响因素 v物理因素：温度、压力、震动、溶剂清

10、洁度、 试剂纯度、重力、外加物理场等 v生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加 剂的类型和浓度等 v其他：溶液过饱和度、纯度等 “经验” “机器人” （2）晶体生长过程及影响因素 （3）结晶方法 批量结晶法 batch crystallization 透射法 crystallization by dialysis 液相扩散法 liquid diffusion 气相扩散法vapor diffusion 氢氘交换质谱技术 Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, DXMS 生物玻璃bioglass （4）晶体的初步

11、鉴定 小分子晶体蛋白质晶体 边界完整，漂亮常不完整，易出现多晶 硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉 脱水不变化因脱水而变坏 溶解性慢快 偏光性强相对弱 染色性弱强 漂浮性下沉漂浮 （5）衍射数据收集 晶体的处理：低温液氮气冷流技术 数据收集仪：底片、面探测器 衍射分析仪器的发展 射线种类：连续射线 特征射线 电子衍射 中子衍射 探测技术：胶片 闪烁体计数器（点） （IP）CCD探 测器（面） 图2-22 2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分） *右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，代表K衍射 底片（外森堡相机、徘循相机） 优点： 多点同时收集 容易保存 价格便宜 q缺点

12、o 存在“化学雾”背景和X射线散射背景 o 费时、费力 计数管（四圆衍射仪） 将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后 再转换成数字存入计算机随时调用 逐点收集数据 优缺点与底片相反 面探技术-SMART APEX-CCD衍射仪 Smart CCD Overview SMART APEX- CCD探测器 金属丝构成的面板，可同时多点收集 将X射线光子强度转换为电信号 集计数管的精确和底片的多点收集效率 面探技术-SMART APEX-CCD衍射 仪 图像板image plate 面探测器的改进 由化学材料构成，整块板子密度一致 高分辨率 可见光下可测量 集底片和面探测器的优点于一身 （6）数据

13、分析 电子密度修饰 电子密度图诠释 结构模型精化 数据处理软件：Denzo, Scalepack 三、X射线晶体结构测定优点 分辨率高 不损伤样品 无污染 相对快捷 能得到晶体完整性的大量信息 晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态 的构象； 很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构 分析的足够大的单晶；（瓶颈） X射线晶体衍射的工作流程较长。 四、X射线晶体结构测定存在问 题 Last update: Tuesday Oct 20, 2009 at 5 PM PDT 于1971年和1972年分别得到分辨率为 2.5埃和1.8埃的猪胰岛素晶体测定， 这是中国阐明的第一个蛋白质的三维 结构。 猪胰岛素(蛋白质编号4ins)的两条小链 “中国蛋白质晶体学研究水平和 世界发达国家一样高！ 胰岛素晶体最好的电子密度图 在北京，不在牛津。” 多萝西霍奇金 ，1972 五、应用实例 1.胰岛素 2.