化生专业微生物-第7章-微生物的生长

1、 生长（growth）：生物个体物质有规律地、不 可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。 繁殖（reproduction）：生物个体生长到一定 阶段，通过特定方式产生新的生命个体，引 起生命个体数量增加的生物学过程。 微生物生长（microbial growth）：在一定时 间和条件下微生物细胞数量的增加。 Chapter7-1-测定生长繁殖的方法 （Methods for determining cell density ） 微生物的生长情况通过测定单位时间 里微生物数量或生物量（biomass）的变化 来评价。 通过对生长的测定可以客观地评价培 养条件、营养物质等对微生物生长的影响 ，或

2、评价不同的抗菌物质对微生物作用的 效果，也能客观地反映微生物生长的规律 。 通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞 微生物的生长情况或样品中所含微生物个 体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。 一、计数法（Counting） 1、菌落计数法（colony-counting method） 准备平板计数的平板的方法 涂布法（spread plate） 混菌法（pour plate） 一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以 一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。 最常用的活菌计数法，原理是每个活细菌在 适宜的培养条件下可以通过生长形成肉眼可见的

3、菌落。 厌氧菌的菌落计数可以采用半固体深层琼脂 法。 当样品中菌数很低时，可以将一定体积 的样品（湖水、海水或饮用水等）通过膜过 滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行 培养，对形成的菌落进行统计，这种方法称 为膜过滤培养法。 2、显微镜直接计数法 （counting them under a microscope） 没有计数板时，可将已知颗粒浓度的 样品与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在 显微镜下根据二者之间的比例直接推算待 测微生物细胞浓度。 当样品中菌数很低时，可将一定体积 的样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、 染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下 计算膜上的菌数； 采用特定的染色技术（如

4、美蓝染色） 可分别对活菌和死菌进行分别计数； 二、生物量测定法 （Follow the amount of important cellular component ） 通过对微生物群体浓度、重量和 一些生理指标的测定来间接判断微生 物的生长情况，对多细胞微生物也可 以测定。 原理是一定范围内，菌悬液中的细胞浓度 与浑浊度成正比，与透光度成反比。 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以 光密度（optical density, 即OD）表示菌量。 1、比浊法（turbidity） 以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量； 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方 法 2、重量法（weight） 3、

5、 生理指标法（physiological index） 选择测定与微生物生长量平行的生 理指标，如蛋白质、核酸含量，呼吸强 度，耗氧量、酶活性、生物热等，来间 接判断微生物生长量。 常用于对微生物的快速鉴定与检测 Chapter7-2-微生物的生长规律 （Regularity of Microbial Growth） 微生物能在各种环境条件下很快地 生长繁殖，但受到各种因素的影响，其 生长速率并不是稳定的，因此，并不能 够无限制地繁殖。在一个密闭容器中， 微生物的群体生长显示了一定的规律性 。 一、单细胞微生物的典型生长曲线 （Traditional growth curve of singl

6、e-cell microbe） 生长曲线（Growth curve）：定量描述液体 培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。 把少量纯种单细胞微生物接种到定量的液 体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养 时间为横座标，以菌数的对数为纵座标作图， 得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化 规律的曲线。 根据微生物的生长速率常数，生长曲线可以分为： 延滞期，对数期，稳定期和衰亡期等4个生长 时期 也称调整期、适应期，指将少量菌种接 入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不 立即增加，或增加很少的一段时期。 1、延滞期（lag phase） （1）延滞期的特点 分裂迟缓、代谢活跃 生长速率常数为0；

7、细胞形态变大或增长； 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高 ； 合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP 的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。 例如巨大芽孢杆菌，在延滞期末，细胞 的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处 于延滞期的细菌细胞体积最大。 （2）延滞期出现的原因 微生物接种到一个新的环境，暂时缺 乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充 足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合 成中间代谢产物，就需要一段适应期。 调整代谢 （3）缩短延滞期的方法 通过遗传学方法改变种的遗传特性； 利用对数生长期的细胞作为种子； 接种前后所使用的培养基组成不要相差太 大； 适当扩大接种量。 延滞期的

8、长短与菌种的遗传性、菌龄 以及移种前后所处的环境条件等因素有关 ，短的只需要几分钟，长的需数小时。 2、对数期（log phase） 又称指数生长期（exponential phase）， 指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞 数以几何级数增长的时期。 生长速率常数最大，代时最短； 细胞进行平衡生长，菌内各成分十分均 匀； 酶系活跃，代谢旺盛。 （1）对数期的特点 对数生长期的细菌个体形态、化学组成 和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅 速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢 的良好材料。它也常在生产上用作种子，使 微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。 繁殖代数（n）：一定时间内细胞分裂

9、的次数 。 生长速率常数（growth rate constant，R）： 单位时间内细胞分裂的次数。 代时（Generation time，G）：在细菌个体生 长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间。 倍增时间（Doubling time）：在群体生长里 细菌数量增加一倍所需的时间。 （2）对数期的重要参数 （3）影响代时的因素 菌种：不同的微生物及微生物的不同菌 株代时不同； 营养成分：在营养丰富的培养基中生长 代时短； 营养物浓度：一定范围内，营养物浓度 既影响生长速率也影响总生长量； 温度：一定范围，生长速率与培养温度 呈正相关。 又称恒定期或最高生长期，生长速率常 数降为0（即细菌分裂

10、增加的数量等于细菌 死亡数），菌体产量达到最高点。 3、稳定期（stationary phase） 生长速率常数为0，菌体产量达到最高点； 储存糖原等细胞质内含物； 积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素 的大量形成也在此时期； 芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态 等。 （1）稳定期的特点 生产上常通过补充营养物质或取走代谢产 物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气 、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得 更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。 （2）稳定期出现的原因 营养物特别是生长限制因子的耗尽； 营养物比例失调； 酸、醇、毒素等有害代谢物的积累； pH、氧化还原电位等物理化学条

11、件不适 宜； 细菌个体死亡速率超过新生速率，整个 群体呈现出负增长（R为负值）。 4、衰亡期（decline或death phase） R为负值； 细胞呈现多种形态，如产生畸形，大小悬 殊，革兰氏染色反应变化等； 细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些 产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素 等。 （1）衰亡期出现的原因 营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累 ； （2）衰亡期的特点 二、连续培养、同步培养和高密度培养 连续培养（continuous culture ） ： 又称开放 培养（open culture），是指在一个恒定容积 的流动体系中培养微生物，一方面以一定流速 不断加入新的培养基

12、，另一方面又以同样的流 速流出培养物，使体系中的细胞数量和营养状 态保持恒定的培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同 样的速率移出培养物是实现微生物连续培养 的基本原则。 控制连续培养 的方法 恒浊连续培 养 菌体浓度 恒化连续培 养 营养物质浓 度 同步培养（Synchronous culture） ：使群体 中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于 同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长 或分裂的培养方法。 高密度培养（HCDC）：也称高密度发酵， 一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度 超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养 技术。 Chapter7-3- 微生物的培养法概论 （

13、Overview of Microbial Culturing） 不同微生物有不同培养条件的需求，良 好的微生物培养装置的基本条件是：按微生 物的生长规律进行科学设计，能在提供丰富 而均匀的营养物质的基础上，保证微生物获 得适宜的理化条件，以及严防杂菌污染。 微生物培养技术的发展 l 从小规模培养到大规模培养； l 从固体培养到液体培养； l 从单批培养到连续培养； l 从利用微生物细胞到利用动植物细胞培养 ； l 从利用野生型菌株到变异菌株和遗传工程 菌株； l 从单菌发酵到混菌发酵； l 从低密度培养到高密度培养； l 从人工控制的发酵罐到自动化发酵罐。 一、实验室培养 （Culture

14、methods in laboratory） 1、固体培养法（on solid medium） （1）好氧菌（aerobes） 主要用试管斜面（test-tube slant）、 培养皿琼脂平板（agar plate）及较大型的 克氏扁瓶（kolle flask）、茄子瓶等进行平 板培养。 （2）厌氧菌（anaerobes） 培养厌氧菌需要特殊的培养装置和特 殊的培养基。 用培养厌氧菌的方法主要有： 高层琼脂柱、厌氧培养皿、Hungate滚管 技术、厌氧罐（anaerobic jar）技术、 厌氧手套箱（anaerobic glove box） 。 2、液体培养（in liquid mediu

15、m） （1）好氧菌（aerobes） 氧的供应是好氧菌生长繁殖的限制因 子，为保证溶解氧浓度，必须增加培养液 和氧的接触面或提高氧分压：浅层培养； 振荡培养；深层液体培养器的底部通入加 压空气；对培养液进行机械搅拌。 （2）厌氧菌（anaerobes） 在培养基中加还原剂（如巯基乙酸、半 胱氨酸、维生素C或庖肉等、铁丝等）； 用深层培养并或在液面上封以凡士林- 石蜡层； 放入厌氧罐或厌氧手套箱中培养。 二、生产实践中的培养 （Culture methods in industry production） 1、固态培养法（on solid medium） 好氧菌的曲法培养；厌氧菌的堆积培养 法

16、2、液体培养法（in liquid medium） 好氧菌的浅盘培养（shallow pan cultivation） 深层液体培养 发酵罐（fermenter） 生长是微生物与外界环境因素共同作 用的结果。环境条件的改变，在一定限度 内，可引起微生物形态、生理、生长、繁 殖等特征的改变。当环境条件的变化超过 一定极限，则导致微生物的死亡。 Chapter7-3-环境对微生物生长的影响 （Environmental Effects on Growth） 主要因素：营养条件、理化因素、生物因素 一、温度（Temperature） 不同微生物的生长温度范围有宽有 窄，但都有最低生长温度，最适生长温

17、 度，最高生长温度这3个重要指标，即生 长温度三基点（three cardinal point）。 把微生物作为一个整体来看，其温 度的三基点极其宽。 根据生长温度的范围，可把微生物 分为宽温微生物和窄温微生物。 最适生长温度 （optimum growth temperature）： 某种微生物分裂代时最短或生长速率 最高时的培养温度。 嗜冷 微生物 兼性嗜冷 微生物 嗜温 微生物 嗜热 微生物 超嗜热 微生物 二、氧气（Oxygen） 好氧菌 （aerobes ） 厌氧菌 （anaerobes ） 专性好氧菌（obligate aerobes） 兼性厌氧菌（facultative anae

18、robes） 微好氧菌（microaerophilic bacteria） 耐氧菌（aerotolenrant anaerobes） 厌氧菌（anaerobes） 氧对不同微生物在半固体琼脂柱中生长的影响 effect of oxygen concentration on the growth of various bacteria in tubes of semi-solid medium 厌氧菌的氧毒害机制 超氧化物歧化酶（SOD） 学说 严格厌氧菌无SOD活力，无过氧化氢酶活 力； 好氧菌有SOD活力，有过氧化氢酶活力； 耐氧菌有SOD活力，有过氧化物酶活力； O2 + 2H+H2O2

19、+ O2 H2O + 1/2O2 2H2O 过氧化氢酶 过氧化物酶 SOD 三、pH值（pH value） 微生物作为一个整体来说，其生长 的pH范围极广（2 10），少数种类还可 以超出此范围。但绝大多数微生物的生 长pH在5 9之间，不同微生物生长的pH 也存在最高、最适和最低3个数值。 微生物类型pH范围举例 嗜酸微生物2.04.0 氧化硫硫杆菌、嗜酸热硫化叶菌、 隐蔽热网菌； 耐酸微生物3.56.0醋杆菌属、乳杆菌属、多类真菌； 嗜中性 微生物 6.08.0 多数微生物在中性pH的环境中 生长良好；但多数细菌宜偏碱性（ pH 8 左右）； 例如产碱菌属、假单胞菌属、 根瘤菌属、硝化细菌

20、、放线菌等； 嗜碱性 微生物 9.010.0 嗜盐碱杆菌属、外硫红螺菌属、 某些芽孢杆菌； Chapter7-5- 有害微生物的控制 （Control of Harmful Microbe） 在我们周围的环境中，到处都有各种微 生物存在，其中有一部分是对人类有害的。 它们通过多种方式传播到合适的基质上造成 种种危害，所以控制（有害）微生物的生长 速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中 具有重要的意义。 抑制宿主体内 的病原菌 杀死所有微生物 （包括芽孢） 杀死病原微生物 （营养体细胞） 抑制霉腐微生物 抑制（inhibition）：生长停止 杀死（killing）：生长能力不可逆 丧失 控制措

21、施 防腐（antisepsis） 化疗（chemotherapy ） 消毒（disinfection ） 灭菌（sterilization ） 一、基本概念（Basic conceptions） 1、灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素使任何物体内外 部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力 的措施。例如高温灭菌和辐射灭菌。 2、消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，杀死物体表 面或内部一部分对人体或动植物有害的病 原菌，而对被处理对象基本无害的措施。 例如一些常用的对皮肤、水果、饮用 水进行药剂消毒的方法和对啤酒、牛奶、 果汁等进行的巴氏消毒法。 3、防腐（a

22、ntisepsis） 利用某种理化因素完全抑制霉腐微生 物的生长繁殖，即通过制菌作用（ bacteriostasis）防止食品、生物制品等对 象发生霉腐的措施。 低温：冰箱； 缺氧：抽真空、 充氮 干燥：晒干、烘干； 高渗：盐腌、糖 渍 高醇度：用酒泡； 高酸度：泡菜； 加防腐剂：苯甲酸、山梨酸 4、化疗（chemotherapy） 即化学治疗，是指利用具有高选择 毒力即对病原菌具有高度毒力而对宿主 基本无毒的化学物质来抑制宿主体内的 病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗 该宿主传染病的措施。 用于化疗的化学物质称为化学治疗 剂，有化学合成药物、抗生素、生物药 物素和中草药有效成分等。 物理灭菌

23、因素的种类很多，主要 是高温、辐射、超声波、微波、激光 和静电压等。另外通过稀释、过滤等 物理措施也能除菌。其中，高温是最 常用、方便、有效的方法。 二、物理灭菌因素的代表 高温 高温的致死作用，主要是引起蛋白质、 核酸和脂类等重要生物大分子发生降解或空 间结构改变，从而变性或破坏。 1、高温灭菌的种类 干热灭菌（dry heat sterilization） 湿热灭菌（moist heat sterilization） 一种最彻底的干热灭菌法，破坏力 很强，应用范围只局限于接种环、接种 针的灭菌或带病原菌的材料和动物尸体 的烧毁。 （1）灼烧法（incineration） 把金属器械和洗净的

24、玻璃器皿放在 电热烘箱中，连续在160下处理2个小 时以上，可达到彻底灭菌的目的。 （2）烘箱灭菌法（dry heat in oven） 在相同作用温度和时间下，湿热灭 菌比干热灭菌更有效，因为蒸汽穿透性 力强，能破坏保持蛋白质空间结构和稳 定性的氢键，加速变性，而且还存在潜 热。 湿热灭菌对一般营养体和孢子的杀灭条件： 多数细菌和真菌的营养细胞：60左右，5-10分钟； 酵母菌和真菌的孢子：80以上， 5-10分钟； 细菌的芽孢：121，15分钟以上； （3）巴氏消毒法（pasteurization） 是一种低温湿热消毒法，一般是60- 85处理15秒至30分钟。具体方法可以分 为两类：低温

25、维持法（LTH）是在63 维 持30min，高温瞬时法（HTST）是在72 下保持15s。 专门用于啤酒、牛奶、果酒和酱油等 不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料 的消毒，可杀灭物料中的无芽孢病原菌而 不影响风味。 （4）煮沸消毒法（boiling） 100 下煮沸几分钟。用于饮用水的消 毒。 （5）间歇灭菌法（intermittent boiling） 将待灭菌的培养基在80100 下蒸煮 15 60min，然后室温保存或37 保温过 夜，第二天再同法蒸煮并保温过夜，连续 重复3天即可在较低温度下达到彻底灭菌的 效果。用于不耐热培养基的灭菌。 （6）常规加压蒸汽灭菌法 （normal aut

26、oclaving） 也称为“高压蒸汽灭菌法”，操作简便 、效果可靠，被广泛使用。 待灭菌物件放在盛有适量水的加压灭菌 锅内，加热煮沸，当蒸汽将锅内的空气驱尽 ，锅盖的阀门关闭后，温度可以上升到100 以上，达到较好的灭菌效果。 一般条件是121，15分钟或115，30分 钟。 （7）连续加压灭菌 （continuous autoclaving ） 也称“连消法”， 用于大型发 酵厂的大批培养基灭菌。 让培养基在管道的流动过程中快 速升温、维持和冷却，然后流进发酵 罐。 一般条件是135-150，5-15秒 。 十倍致死时间（decimal reduction time，DRT ）： 在一定温度

27、条件下，微生物数量十倍减少 所需要的时间。 热致死时间（thermal death time，TDT）： 在某温度下，杀死某微生物的水悬浮液群 体所需的最短时间。 热致死温度（thermal death point，TDP）： 在10min内，杀死某微生物的水悬浮液群 体所需的最低温度。 2、定量指标 3、影响加压蒸汽灭菌效果的因素 l 灭菌物体含菌量 l 灭菌锅内空气排除的程度 l 灭菌对象的pH l 灭菌对象的体积 l 加热与散热的速度 能够制菌和杀菌的化学物质很多，有 生物合成的天然产物，也有人工合成的化 合物。 根据对宿主细胞毒力的选择性，可以 分为表面消毒剂和抗代谢药物、抗生素、 生

28、物药物素两大类。 三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂 评价化学物质的药效和毒性的3个主要指标 最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）：一定条件下，某化学 药剂抑制指定微生物的最低浓度。 半致死剂量（50% lethal dose，LD50）：一 定条件下，某化学药剂能杀死50%试验生物 时的剂量。 最低致死剂量（minimum lethal dose，MLD ）：一定条件下，某化学药剂能引起试验生 物群100%死亡率的最低剂量。 药效测定方法 最低抑制浓度试验（液体培 养法） 药效测定方法 抑菌圈（zone of inhibition ）试验 （平

29、板培养 法） 是指对一切活细胞都有毒性，不能用 于活细胞或机体内治疗用的化学药剂。 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强 度，常用在临床上最早使用的消毒剂 石炭酸作为比较标准。 1、表面消毒剂（surface disinfectant） 石炭酸系数（phenol coefficient，P.C.）：指在一定时间内 被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸 的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，供试菌为 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。 常用消毒剂按杀菌作用强弱可分为3大类： 1、高效消毒剂：过氧乙酸和含氯消毒剂等。 2、中效杀毒剂：乙醇、碘伏（强力碘）、碘

30、 酊和煤酚皂液（来苏儿）等。 3、低效消毒剂：氯已定（洗必泰）、苯扎溴 胺（新洁尔灭）、玉洁新（三氯散）和高锰 酸钾等。 杀菌能力越强的消毒剂，其刺激性、毒 性和腐蚀性往往也随之增大。在家庭中一般 是使用中效和低效的消毒剂。 化学消毒剂的作用机制主要有3个方面： 1、改变细胞膜通透性：表面活性剂、酚类及 醇类 。 2、蛋白变性或凝固失去生物活性，导致细菌 死亡：如乙醇、大多数重金属盐、氧化剂、醛 类、染料和酸碱等。 3、改变蛋白与核酸功能基团，使菌体酶蛋白 失去酶的活性： 某些氧化剂和重金属盐类能与 细菌的-SH基结合并使之失去活性。 又称代谢拮抗物或代谢类似物，是一 类在化学结构上与生物体所必需的代谢物 很相似，并可干扰正常代谢活动的化学物 质。有良好的选择毒力，是重要的化学治 疗剂。 叶酸对抗物（磺胺）；嘌呤对抗物（6-巯基嘌