工业微生物育种诱变剂

1、第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容： 化学诱变剂 物理诱变剂 生物诱变剂 2 诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。 3 4 5 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配 的概率也高 碱基类似物是如何提高突变频率的? （一）碱基类似物的诱变机制 现以5-BU为例来分析碱基类 似物的诱变机制。当胸腺嘧啶分 子结构中5位碳原子上的甲基被溴 （Br）原子取代，就构成了5-BU 的结构式。 5-溴尿嘧啶（5- BU）的结构 7 5-溴尿嘧啶（5-BU）的 碱基配对 8 A A G G T BUK BUE

2、 C 酮式 烯醇式 9 G C G BUe G C G BUe G C A= T A=B Uk A:T A: BUk A:T G BUe A:T G C G BUe G CA=T 5-BU掺入错误 A: T G C 由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因 此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。 细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子， 但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5- BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。 11 12 A 2AP 2AP* G T T C C （二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例） 5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或 乙醇。诱变处理

3、方法如下： 1.单独处理 新鲜斜面的细菌转接到前培养 的液体培养基中培养到对数期 离心除去培养液加入生理 盐水或缓冲液饥饿培养810小 时加入5-BU到培养液中，使最 后的处理浓度为2540g/ml,混合 均匀取0.10.2ml菌悬液加入 到琼脂平板上涂布培养在适宜 温度下，使之在生长过程中诱变处 理培养后挑取单菌落，进行筛 选。 真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的 浓度（0.11mg/ml），加到孢子悬液 后，进行振荡培养数小时(一般6 12h)分离于平皿适温培养 挑取单菌落，进行筛选。 2.与辐射线复合处理 据报道，如果菌体先用5-BU 等碱基类似物进行处理，使它们首 先渗入到DNA分子

4、中，然后用辐射 线照射，诱变效果会比单独使用辐 射线更好。因此，碱基类似物也是 一种辐射诱变的增敏剂。 15 （a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 16 No Image No Image 17 亚硝酸的脱氨基作用 及其诱发的突变 18 HNO2 A H G G A A T C C C U T HNO2 A:T GC 亚硝酸的处理方法 试剂的配制 （1）1mol/LpH4.5醋酸缓 冲液（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶 液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸 氢二钠溶液 2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例） 取孢子悬液1ml，pH4.

5、5醋酸缓冲液 2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶液1ml，最 后处理浓度为0.025mol/L。于25 26保温1020min，加入0.07mol/L 、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使 pH下降至6.8左右，以终止反应。稀 释分离于平板。 如果是处理细菌，亚硝酸最后 浓度以0.05mol/L为例：将斜面新鲜 菌体移入肉汤培养基，适温培养到 对数期，将培养液进行离心，弃去 上清液，用生理盐水洗涤。pH4.5醋 酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1:1 浓度加入沉淀的菌体中，使之悬浮 。于3537处理510min、加入5 倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液，使pH 下降到6.8。取一定量进行

6、后培养 1.52h。然后稀释分离于平板上。 注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度 ，否则会影响诱变效果。 No Image No Image 21 羟胺的诱变机制 改变了结构的 胞嘧啶 根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使 A:T G:C转换，进行逆向突变。 由于羟胺是诱发G:C A:T的专 一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是A:T G:C还是G:C A:T转换。 羟胺的处理方法：常用浓度为0.15%，可直接 在溶液中处理，时间12h，然后分离培养。但一般 都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或 细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度 比直接处理时低些。 烷化剂是

7、诱发突变中一类相 当有效的化学诱变剂，这类诱变 剂具有一个或多个活性烷基，它 们易取代DNA分子中活泼的氢原子 ，直接与一个或多个碱基起烷化 反应，从而改变DNA分子结构，引 起突变。 双功能烷化剂 单功能烷化剂 多功能烷化剂 根据烷化剂 中活性烷基 的数目 亚硝基类、磺酸酯 类、硫酸酯类、重 氮烷类、乙烯亚胺 类化合物 硫芥子、氮芥子类 等 25 烷化碱 基 部分烷化 剂 部分烷化剂 和 烷化碱基 甲基磺酸甲 酯 亚硝基乙基 脲 7-甲基鸟嘌 呤 3-甲基腺嘌 呤 O6-甲基 鸟嘌呤 烷化剂的诱变机制 烷化剂主要使通过烷化基团使 DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化， DNA复制时导致碱基配对错

8、误而引起 突变。 碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤 类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位 点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作 用；甲基磺酸乙酯主要使嘌呤N7烷基 化。 其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2、腺嘌 呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作 用的10%左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅 是少数。 此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6、 胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。 如果鸟嘌呤N7等位点被烷化后 ，它和核糖结合键发生水解反应，引 起鸟嘌呤从DNA分子上脱落下来，使 DNA链上碱基空缺，在以后的复制过程 中其它游离碱基有可能错误掺入。 GC

9、就可能变为任何碱基对 G:CA:T转换及G:CC: G或 G:CT: A 颠换而导致突变。 由于烷基化后的鸟嘌呤， 易离子化，由原来的酮式变为不稳 定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对， 而是与胸腺嘧啶错误配对，结果发 生G:CA:T转换而导致突变。 烷化鸟嘌呤的碱基配对 烷化剂除了以上诱变作用之外 ，还有可能使两个鸟嘌呤N7位点形成 共价键，一般双功能烷化剂容易引 起DNA双链间的交联，造成变异或死 亡。 32 总结鸟嘌呤 N7位点的烷 化作用 烷化剂的性质 烷化剂的性质比较活泼，不太 稳定，在水溶液中容易发生水解。 它们大部分半衰期很短，其长 度与温度、溶液pH关系很大。因此 ，化学诱变剂要现用现

10、配。 不少烷化剂见光后，容易发生 光化学反应，和水解作用一样，有 的分解产物会失去诱变作用或具毒 性。因此，保藏时要注意避光，置 棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保 存。 另外，配制烷化剂溶液时，要 采用合适的pH缓冲液。 烷化剂名称烷化剂名称 理化特性理化特性pH7pH7水中半衰期水中半衰期/h/h 分子分子 量量 状态状态水溶性水溶性溶点或沸点溶点或沸点202030303737 甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯 (EMS)(EMS) 无色液体无色液体约约8%8% 沸点沸点 8586/10mmH8586/10mmH g g 9393262610.410.4124124 乙烯亚胺乙烯亚胺(EI)(EI)无

11、色液体无色液体易溶于水易溶于水沸点沸点56/760mmHg56/760mmHg4343 亚硝基乙基脲亚硝基乙基脲 (NEU)(NEU) 粉红色液粉红色液约约5%5%沸点沸点53/5mmHg53/5mmHg8484117117 亚硝基甲基脲亚硝基甲基脲 (NMU)(NMU) 黄色固体黄色固体3535103103 硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)(DES) 无色油状无色油状 物物 不易溶不易溶3.343.341 10.50.5 亚硝基胍亚硝基胍(NTG)(NTG)黄色固体黄色固体熔点熔点118118 烷化剂的某些性质 几种常用的烷化剂： 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称 亚硝基胍，NTG或NG

12、或MNNG） 为黄色结晶状物质，性质不稳定 ，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色 变为绿色，诱变效应降低。须保存在 棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条 件下贮存。 NTG不溶于水，须加助溶剂，使用 时现配现用。 NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生 一次或多次突变，诱变效果好，尤其 适合于诱发营养缺陷型突变株。其中 处理细菌、放线菌等微生物时，不经 淘汰，就可以直接得到10%以上的营养 缺陷型突变株。而用一般诱变剂处理 只能达百分之几至千分之几。 NTG的水溶液中随着不同的pH将 产生不同的分解产物，从而影响诱 变效应。 当溶液pH低于5.5时，NTG分解成 HNO2, HNO2本身就具诱变作用；

13、当溶液pH在8.0以上时，NTG会分 解产生重氮甲烷（CH2N2），对核酸 起烷化作用，引起微生物突变； 当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA 起烷化反应而导致突变。 通常在pH6.0的条件下进行诱变处理 。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果 ，因此，无论是配制NTG溶液，还是 制备均悬液都要用适宜的缓冲溶液 。常用的由磷酸缓冲液和Tris缓冲 液. 1.取新鲜的斜面，用一定pH值的 缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制 成菌悬液。如果采用细菌细胞或 丝状菌孢子（真菌或放线菌）须 进行前培养，可用有关培养基代 替以上缓冲液，孢子培养时间控 制在大部分孢子处在萌动阶段， 经离心、洗涤，用缓冲液制成

14、悬 液，浓度约在106-107ml-1； NTG的诱变处理方法： 2.配制NTG母液： 由于NTG不溶于 水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙 酮少许，然后加缓冲溶液，其比 例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙 酮溶液1ml），一般NTG母液浓度 配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml ，加菌悬液1.8ml，NTG最后处理 浓度为100g/ml。一般处理浓度 随菌种不同而异，通常细菌为 1001000g/ml，而放线菌、真 菌孢子为10003000 g/ml 。 3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于 一试管内，置该菌生长适宜的温 度下保温处理若干时间。 4.终止反应。用冷的生理盐水稀 释到50倍以上或

15、在低温下进行离 心洗涤，除去药液，加无菌水使 沉淀悬浮并作成一定稀释度分离 于平皿。 处理完毕后，马上把接触过NTG的 器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。 除以上直接以溶液处理外，也可以进 行如下方法诱变处理： 1.摇瓶振荡处理 2.在平皿上生长过程处理 NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手 套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在 通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单 独处理，例如用自来水大量冲洗或用12mol/L的 NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。 41 G O-6-E-G A T O-4-E-T C C T T A G G 42 溴化乙锭（EtBr

16、） 由美国的肿瘤研究所合成，故名。这是一些由 烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物。 43 B嵌入到旧链上 导致插入突变 A嵌入到新 合成链上导 致缺失突变 移码诱变剂的嵌入并不导致突变 ，必须通过DNA的复制才形成突变， 因此这类诱变剂只能作用于生长态 的细胞。 分子生物学实验室中利用溴化乙 锭能嵌入到DNA分子的特性，将其作 为常用的DNA染料； 在微生物遗传育种中溴化乙锭是 酵母菌小菌落突变型的有效诱变剂 。 45 重视化学诱变剂的操作安全 化学诱变剂多数是极毒的 致癌药品，在进行诱变操作后的处 置以及诱变剂的保藏等方面的安全 防护都是及其重要的。如有疏忽， 就可能对人体健康的环境带来恶果

17、 ，万万不可麻痹。 使用化学诱变剂一般要求避光、密 封、低温、干燥等； 尽可能不触及人体任何部位； 对残余物要及时进行消毒、稀释处 理。 47 物理诱变剂是指通常使用物理辐射中的各种射 线，包括紫外线、X射线、射线、快中子、射 线、射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和 宇宙线等。 48 No Image No Image 49 O O UV O O H CH3 H CH3 H CH3 CH3 H N N N N O N H O N H O N H H N O Thymine Thymine Thymine dimer O O 4 5 4 5 3 6 6 2 1 Fig. 21- Produc

18、tion of thymine dimer by ultraviolet light irradiation. 50 51 52 53 54 55 56 57 诱变剂诱变剂 在在DNADNA上的初级效应上的初级效应 遗传反应遗传反应 碱基类似物碱基类似物 掺入作用掺入作用 ATATGCGC转换转换 羟胺羟胺 同胞嘧啶起羟化反应同胞嘧啶起羟化反应 GCATGCAT转换转换 亚硝酸亚硝酸 A A、C C的脱氧基作用的脱氧基作用 DNADNA交联交联 ATGCATGC转换转换 缺失缺失 烷化剂烷化剂 烷化碱基（主要是烷化碱基（主要是G G）而导致：）而导致： 脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用脱嘌呤作用；烷化碱基的互变异构作用 ；DNADNA链的