第7章第2节PCR技术(3LMJ)'

1、基因操作基因操作 第七章第七章 gene manipulatinggene manipulating 2021年年5月月7日日19时时05分分1 pcr polymerase chain reaction 2021年年5月月7日日19时时05分分2 http:/ pcr(polymerase chain reaction)技术是技术是19851985年年 由美国科学家由美国科学家kary b mullis发明的体外基因片段扩发明的体外基因片段扩 增的方法。增的方法。 一、一、pcr技术的产生技术的产生 2021年年5月月7日日19时时05分分3 2021年年5月月7日日19时时05分分4 二、

2、二、pcrpcr技术的基本原理技术的基本原理 dnadna模板变性模板变性 (denature)(denature)： 95 95左右高温使模板左右高温使模板dnadna完全变性。完全变性。 单链单链dnadna模板与引物退火模板与引物退火 (annealing)(annealing)： 5555左右引物与模板形成复合物的几左右引物与模板形成复合物的几 率率dnadna分子自身的复性。分子自身的复性。 引物的延伸引物的延伸 (extension)(extension)： 72 72左右耐热左右耐热dnadna聚合酶在最适温度下聚合酶在最适温度下 催化催化dnadna合成反应。合成反应。 202

3、1年年5月月7日日19时时05分分5 5 primer 1 5 primer 2 cycle 2 cycle 1 5 5 5 5 5 5 template dna 5 5 5 5 5 5 5 5 pcrpcr技术的基本原理示意图技术的基本原理示意图 taqtaq酶酶 taqtaq酶酶 2021年年5月月7日日19时时05分分6 cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，次循环后， pcr pcr的扩增倍的扩增倍 数为数为(1+x)(1+x)n n, x=75%, n, x=75%, n为循环数。为循环数。 2021年年5月月7日日19时

4、时05分分7 dna polymerase dntps pcr buffer, mg2+ primers template dna pcr pcr体系的体系的5 5种基本组成成分种基本组成成分 2021年年5月月7日日19时时05分分8 pcr 反反 应应 循循 环环 变性变性 9395c左右左右 延伸延伸 酶最适温度酶最适温度 退火退火 引物引物tm-5c 经过经过3030个左右的循环后，个左右的循环后，模板模板dna的的 含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。 2021年年5月月7日日19时时05分分9 思考题思考题 1 pcrpcr技术的主要特点技术的主要特点 1.特异性强特

5、异性强 2.灵敏度高灵敏度高 3.简便快速简便快速 4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 2021年年5月月7日日19时时05分分10 u衡量衡量pcr好坏的参数：好坏的参数： 特异性特异性specificity:最好最好 只有目的只有目的dna带。带。 真实性真实性fidelity:dna序序 列正确。列正确。 产量产量q quantity:dna带带 明亮。明亮。 2021年年5月月7日日19时时05分分11 思考题思考题 2 利用利用特异性引物特异性引物以以cdnacdna或基因组或基因组dnadna为模为模 板获得已知目的基因片段。板获得已知目的基因片段。 利用利用简并引物简并引物

6、从从cdnacdna文库或基因组文库中文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。获得具有一定同源性的基因片段。 利用利用随机引物随机引物从从cdnacdna文库或基因组文库中文库或基因组文库中 随机克隆基因。随机克隆基因。 u 用不同引物进行用不同引物进行pcrpcr获取目的基因：获取目的基因： （一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆 2021年年5月月7日日19时时05分分12 (reverse transcription pcr,rt-pcr) pcr 特点：特点：敏感度高、特异性强、省时等。敏感度高、特异性强、省时等。 rt-pcr是从组织细胞中获得目的基因、对已知是从组织细胞

7、中获得目的基因、对已知 序列序列rna进行定性及半定量分析最的有效方法。进行定性及半定量分析最的有效方法。 总总rna ( (或或mrna) ) ss-cdna ds-cdna pcr扩增扩增 2021年年5月月7日日19时时05分分13 u 获取目的基因的特殊获取目的基因的特殊pcrpcr技术：技术： rt-pcr原理原理 aana ttnt 5 5 mrna 反转录酶 mrna cdna3 ttnt aana 核糖核酸酶h ttnt 3 dna poly i cdna 核酸酶s1 双链双链cdnacdna 3 5 3 5 5 加热变性 加入特异性引物 dna聚合酶 pcr 大量的产物大量的

8、产物 2021年年5月月7日日19时时05分分14 -actin 433bp hif-1 359bp 300 bp 500 bp 400 bp 300bp 500bp 400bp 200bp -actin 433bp vegf 238bp rt-pcr的结果举例的结果举例 2021年年5月月7日日19时时05分分15 限制酶切位点限制酶切位点 限制酶消化限制酶消化 cos l r cos cos l 左臂左臂 r cos 右臂右臂 限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源dna与载体与载体dna混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 感染大肠杆菌感染大肠杆菌 7 kb dna 片段片段 c

9、os lr cos7 kb 外源外源 cdna 片段片段 cdna文库文库 c dna 片段片段 5/7/2021 7:05 pm16 重组噬菌体重组噬菌体 锚定锚定pcrpcr 先合成第一链先合成第一链cdnacdna后后, ,添加一同聚物尾添加一同聚物尾(polydg),(polydg),与带与带 有有polydc polydc 限限制性内切位点的制性内切位点的33锚定引物一起扩增。锚定引物一起扩增。 2021年年5月月7日日19时时05分分17 原理：原理： 设计设计“内、外内、外” ” 两对引物：两对引物： -pcr（nested-pcr） 先用外引物进行先用外引物进行pcr反应，从反

10、应，从模板上模板上扩增出扩增出 含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作 为模板用内引物进行第二次为模板用内引物进行第二次pcr反应，扩增出内反应，扩增出内 侧的较短靶序列。侧的较短靶序列。 外引物外引物对应的序列在模板的外侧；对应的序列在模板的外侧； 内引物内引物对应的序列在外引物的内侧。对应的序列在外引物的内侧。 2021年年5月月7日日19时时05分分18 第第1轮轮pcr：1520个循环的标准扩增。个循环的标准扩增。 第第2轮轮pcr：将第：将第1轮轮pcr扩增产物稀释扩增产物稀释1001000倍，倍， 作为模板进行第作为模板进行第2轮轮pc

11、r ，扩增，扩增1520个循环。个循环。 2021年年5月月7日日19时时05分分19 降低了多个靶位点扩增的可能性，因与降低了多个靶位点扩增的可能性，因与2 套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对 作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。 可增加有限量靶序列可增加有限量靶序列( (如稀有如稀有mrna)mrna)的灵的灵 敏度，并且提高了困难敏度，并且提高了困难pcr(pcr(如如5 race)5 race)的特的特 异性。异性。 用外、内用外、内2 2对引物扩增，可大大提高扩增的对引物扩增，可大大提高扩增的 灵敏

12、度和特异性。灵敏度和特异性。 2021年年5月月7日日19时时05分分20 2021年年5月月7日日19时时05分分21 3-race 2021年年5月月7日日19时时05分分22 5-race 5-capaaaaaaaaaa3 mrna gsp11.逆转录逆转录 去除rna和gsp1 2.末端转移酶末端转移酶 3ccccc 3ccccc 3.退火，退火，pcr gsp2 5gactcgagtcgacatcgaggggg-3 xho l sal i clai 3ccccc 5gactcgagtcgacatcgaggggg xho l sal i clai 3ccccc gsp2 5gactcg

13、agtcgacatcgaggggg xho l sal i clai 3. pcr 用限制性内切酶切割克隆即获得用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段末端片段 2021年年5月月7日日19时时05分分23 2021年年5月月7日日19时时05分分24 反向反向pcr (reverse pcr) pcr (reverse pcr) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的dnadna片段对片段对 某个已知某个已知dnadna片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。 2021年年5月月7日日19时时05分分25 电泳电泳 负极负极 正极正极 测序反应测序

14、反应 gatc *2，3双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸 *用用4种不同荧光标记种不同荧光标记 dnadna样品样品 引物、引物、dnadna聚合酶、聚合酶、dntpdntp ddgddaddtddc 5 3 aacgtggacddt ccgattt ttgcacctga ggctaaaaac gtggact aacgtggaddc aacgtggdda dda adda aaddc aacgddt aacddg aacgtddg aacgtgddg u 末端合成终止法测定末端合成终止法测定dnadna序列的原理序列的原理 dna自动测序结果自动测序结果 2021年年5月月7日日19时时05分分27

15、the nobel prize in chemistry 1980 for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-dna for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids paul berg 1/2 of the prize stanford university stanford, ca, usa 1926

16、- walter gilbert frederick sanger 1/4 of the prize 1/4 of the prize harvard university, biological laboratories cambridge, ma, usa mrc laboratory of molecular biology cambridge, united kingdom 1932 - 1918 - 2021年年5月月7日日19时时05分分28 （二）基因的体外突变（二）基因的体外突变 利用利用pcr技术可以随意设计引物在体外技术可以随意设计引物在体外 进行基因的嵌和、缺失、点突变等

17、改造。进行基因的嵌和、缺失、点突变等改造。 利用利用pcr技术构建重组体和突变体的方技术构建重组体和突变体的方 法称为法称为重组重组pcr( (recombinant pcr) )。 特点是简单、省时；利用两对引物很容特点是简单、省时；利用两对引物很容 易的在易的在dna片段的任何位置进行点突变。片段的任何位置进行点突变。 2021年年5月月7日日19时时05分分29 1. 随机突变：随机突变： 应用：应用： 策略：易错策略：易错pcr（error-prone pcr）。）。 利用利用taq dnataq dna聚合酶等没有聚合酶等没有3535校校 对功能的特性，在对功能的特性，在pcrpcr

18、扩增反应中可能掺入扩增反应中可能掺入 错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。 加入加入itpitp并限制某一种核苷酸用量，从并限制某一种核苷酸用量，从 而促进而促进dnadna聚合酶选择其它聚合酶选择其它3 3种核苷酸或种核苷酸或itpitp， 导致产物发生突变。导致产物发生突变。 构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特 殊性质的突变个体殊性质的突变个体 2021年年5月月7日日19时时05分分30 2.2.定点点突变定点点突变 (1) 5(1) 5端引入点突变：端引入点突变： (2) (2) 序列中的点突变：序列中的

19、点突变： 通过修饰上游引物的通过修饰上游引物的55端的碱基序列，端的碱基序列， 可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启 动子序列等。动子序列等。 采用重叠延伸采用重叠延伸pcr(overlap extension pcr(overlap extension pcrpcr，oe pcroe pcr。 2021年年5月月7日日19时时05分分31 pcr 用酶用酶a a和和b b消化、克隆，将突变位点引入消化、克隆，将突变位点引入pcrpcr 重组体。重组体。 (1) 末端引入点突变末端引入点突变 a b p2 p1 ab 2021年年5月月7日日19时时05分分

20、32 ecorihindiii isolate products, mix amplify digest, subclone sequence pvuii (2) (2) 序列中的点突变：序列中的点突变： 2021年年5月月7日日19时时05分分33 例子：例子：s.pn的的ply146aa缺失的突变序列构建缺失的突变序列构建 肺炎链球菌肺炎链球菌s.pn的的ply为一细胞毒性分子，其为一细胞毒性分子，其146 位位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗： 首先设计首先设计4 4个引物：个引物：(m1(m1和和m2m2完全重叠完全重叠) ) p1:

21、5-p1: 5-cgggatcccgggatccatggcaaataaagcagtaaatg-3atggcaaataaagcagtaaatg-3 bamh ibamh i p2: 5-p2: 5-ccgctcgaccgctcgagcaagcattctcctctcctagtc-3gcaagcattctcctctcctagtc-3 xho i xho i m1: 5-ggtcaataatgtccca-agaatgcagtatg-3m1: 5-ggtcaataatgtccca-agaatgcagtatg-3 m2: 5-catactgcattct-tgggacattattgacc-3 m2: 5-c

22、atactgcattct-tgggacattattgacc-3 2021年年5月月7日日19时时05分分34 突变位点突变位点 m2m2 m1m1 p2p2 p1p1 55 55 55 33 33 55 为酶切位点序列为酶切位点序列 1.1.以基因组以基因组dnadna为模板，以为模板，以p1p1和和m1m1为引物扩增出为引物扩增出plyply 上游片断，以上游片断，以p2p2和和m2m2为引物扩增出为引物扩增出plyply下游片断；下游片断； 2.2.以上下游片断为模板，以以上下游片断为模板，以p1p1和和p2p2为引物扩出全长；为引物扩出全长； 3.3.酶切后克隆到质粒中保存。酶切后克隆到

23、质粒中保存。 2021年年5月月7日日19时时05分分35 a b p1 p2 p3 p4 pcr a b pcr a b 3.3.引入大片段缺失引入大片段缺失 2021年年5月月7日日19时时05分分36 4.4.多位点突变多位点突变 策略：多次重叠策略：多次重叠pcrpcr 关键：重叠引物设计关键：重叠引物设计( (每对均需部分重叠，方向相反每对均需部分重叠，方向相反) )。 2021年年5月月7日日19时时05分分37 基基 本本 操操 作作 2021年年5月月7日日19时时05分分38 （三）（三）dnadna的微量分析的微量分析 pcr pcr技术敏感度很高，理论上只要存在技术敏感度

24、很高，理论上只要存在1 1 分子的模板，就可以获得目的片段，是分子的模板，就可以获得目的片段，是dnadna微微 量分析的最好方法。量分析的最好方法。 实际工作中，实际工作中，1滴血液、滴血液、1根毛发或根毛发或1个细个细 胞已足以满足胞已足以满足pcr的检测需要。的检测需要。 2021年年5月月7日日19时时05分分39 （四）（四）mrnamrna的含量分析的含量分析 用于用于rna检测的常用字方法有原位杂交、点杂检测的常用字方法有原位杂交、点杂 交、交、northern印迹杂交及核酸酶保护试验等，都难印迹杂交及核酸酶保护试验等，都难 以检测低丰度的以检测低丰度的mrna，且操作繁琐。，且

25、操作繁琐。 在敏感性方面，在敏感性方面，rt- pcr用于用于mrna定量分析定量分析 要远高于上述传统方法。要远高于上述传统方法。 rt-pcrrt-pcr用于用于mrnamrna定量分析面临的问题：定量分析面临的问题： 在第一步合成在第一步合成cdna的反应中会造成一些误差，的反应中会造成一些误差， 但是更重要和显著的误差是由但是更重要和显著的误差是由pcr反应本身造成。反应本身造成。 2021年年5月月7日日19时时05分分40 u用于定量用于定量pcrpcr分析的两种技术：分析的两种技术： 竞争性定量竞争性定量pcrpcr： 在反应前加入外源标准品在反应前加入外源标准品rna作为内参照

26、；须使作为内参照；须使 用与样品用与样品rna同样的引物识别序列，但产物的大小不同样的引物识别序列，但产物的大小不 同，以在电泳时区别开。同，以在电泳时区别开。 属反应终点分析方法，需用系列稀释标准属反应终点分析方法，需用系列稀释标准rna做做 成标准曲线，样品成标准曲线，样品rna的含量应在标准曲线范围内。的含量应在标准曲线范围内。 实时实时pcr(real time pcr)pcr(real time pcr)： 是近年发展起来的一种是近年发展起来的一种rna微量分析技术；精确微量分析技术；精确 度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。 20

27、21年年5月月7日日19时时05分分41 u实时实时pcrpcr的基本原理的基本原理 在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中 对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。 不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系 统不同：统不同： molecular probe 公司的公司的sybr green 系统系统 perkin-elmer/abd公司的公司的taqman系统系统 invitrogen公司的公司的molecular beacons系统系统 2021年年5月月7日日19

28、时时05分分42 pcr扩 增 时 ，扩 增 时 ， taqtaq酶的酶的5- 35- 3外外 切酶活性切酶活性将探针酶切将探针酶切 降解，使探针上的降解，使探针上的荧荧 光基团光基团和和淬灭基团淬灭基团分分 离，使离，使荧光基团在激荧光基团在激 发光作用下发出发光作用下发出荧光；荧光； 每扩增一条每扩增一条dna 链就有一个荧光分子链就有一个荧光分子 形成，实现了荧光信形成，实现了荧光信 号的累积与号的累积与pcr产物产物 形成完全同步。形成完全同步。 2021年年5月月7日日19时时05分分43 思考题思考题 3 1.1.实时荧光实时荧光pcrtaqman技术技术 rq 53 53 exc

29、itation r q q r q r excitation 实时荧光实时荧光pcrpcrtaqman技术技术 2021年年5月月7日日19时时05分分44 taqmantaqman技术技术的优、缺点的优、缺点 优点：优点：杂交效率高杂交效率高 缺点：缺点： (2) (2) 探针的水解依赖于探针的水解依赖于taqtaq的酶外切活性，的酶外切活性， 故受酶性能和试剂质量影响；故受酶性能和试剂质量影响； (3) (3) 检测点突变的能力相对不足。检测点突变的能力相对不足。 (1) (1) 淬灭难以彻底，本底较高；淬灭难以彻底，本底较高； 2021年年5月月7日日19时时05分分45 rq exci

30、tation r q q r excitation emission 2.2.实时荧光实时荧光pcrpcr分子信标分子信标技术技术 2021年年5月月7日日19时时05分分46 分子信标分子信标技术技术的优、缺点的优、缺点 优点：优点： 荧光本底低。荧光本底低。荧光基团和淬灭基团极荧光基团和淬灭基团极 端靠近；淬灭基团为非荧光物质，不端靠近；淬灭基团为非荧光物质，不 存在对供体荧光测定的干扰，荧光淬存在对供体荧光测定的干扰，荧光淬 灭彻底。灭彻底。 缺点：缺点：设计时需要同时考虑探针和臂的熔点，设计时需要同时考虑探针和臂的熔点， 增加了难度。增加了难度。 2021年年5月月7日日19时时05分

31、分47 sybr green isybr green i是一种只与双链是一种只与双链dnadna小小 沟结合的染料，当它与沟结合的染料，当它与dnadna双链结合时，发双链结合时，发 出荧光；从出荧光；从dnadna双链上释放出来时，荧光信双链上释放出来时，荧光信 号急剧减弱。号急剧减弱。 因此，在一个体系内，其信号强度代因此，在一个体系内，其信号强度代 表了双链表了双链dnadna的量。的量。 3.3.实时荧光实时荧光pcrpcrsybr green i sybr green i 技术技术 2021年年5月月7日日19时时05分分48 sybrsybr greengreen i i荧光染料的

32、作用原理荧光染料的作用原理 2021年年5月月7日日19时时05分分49 sybr green i sybr green i 技术的优、缺点技术的优、缺点 优点：优点：技术简单、方便，而且可适用于任技术简单、方便，而且可适用于任 何何pcrpcr反应；反应； 缺点：缺点：非特异性结合。非特异性结合。 sybr green i 也可也可 与非特异性的双链结合如引物二聚体，与非特异性的双链结合如引物二聚体， 非特异性非特异性pcrpcr扩增产物等扩增产物等 2021年年5月月7日日19时时05分分50 荧光曲线 随着随着pcrpcr反应的进行，扩增产物不断累积，荧反应的进行，扩增产物不断累积，荧

33、光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次 荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图 4.4.实时定量实时定量pcrpcr的定量原理的定量原理 2021年年5月月7日日19时时05分分51 荧光阈值荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强 度标准度标准( (即即pcrpcr扩增产物量的标准扩增产物量的标准) )。 阈值线阈值线 u实时定量实时定量pcrpcr的两个重要概念的两个重要概念 2021年年5月月7日日19时时05分分52 ctct值的概念值的概念 ct ct值的定义是值的定义是pcrpcr扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物( (荧光荧光 信号信号) )到达阈值时所经过的扩增循环次数。到达阈值时所经过的扩增循环次数。 c(t) 值值 c(t) 值值 18.12