中国ALK阳性NSCLC诊断专家共识V14

1、2013 v1.0（草稿）（草稿） 2 目的：目的：提高我国提高我国alk融合基因型肺癌的个体化精准治疗能力融合基因型肺癌的个体化精准治疗能力 （precision therapy） 非小细胞肺癌的个体化靶向治疗：非小细胞肺癌的个体化靶向治疗：伴随分子诊断是前提伴随分子诊断是前提 虽然虽然alk融合基因阳性患者仅占融合基因阳性患者仅占nsclc的的5%，但是，但是总体患者负荷较总体患者负荷较 大，治疗需求迫切大，治疗需求迫切 alk融合基因阳性融合基因阳性nsclc具有独特临床具有独特临床 cancer 2012 glci internal data: 7% (70/977); 7.7% (3

2、1/400) 4 总体原则总体原则 综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子分析方法的特点、实验室综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子分析方法的特点、实验室 自身条件，需要多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，自身条件，需要多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保以保 证证alk融合型肺癌的融合型肺癌的检出率和准确率检出率和准确率 从临床诊断角度出发，综合最新的研究数据，并结合从临床诊断角度出发，综合最新的研究数据，并结合sfda批准的伴随批准的伴随 诊断方法，诊断方法，定期更新定期更新，保证检测结果的，保证检测结果的可信性可信性和临床实际和临床实际可操作性可操作性 5 alk+ c

3、an be enriched in clinical factors: age, histology, smoking status alk+ can be enriched in molecular subtypes: egfrwt, kraswt, and ac 30% in caucasian pts(ac, egfr wt and kras wt) 42% in chinese mailand pts (ac, egfr wt and kras wt) 34% in taiwanese pts (ac egfrwt ) alk+ concomitant with egfr mutati

4、ons: glci data: 1.3% (13/977) overally; in egfr mut pts, 3.9% (13/336) co-alteration rate; in alk+ pts, 18.6% (13/70) co- alteration rate eurtac data (2012 esmo by rosell): in egfrmut pts, 15.8% (15/95) co-alteration rate glci internal data; rosell, esmo 2012; horn, jco 2011 6 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egf

5、r突变检测突变检测 腺癌（粘液性或实性，腺癌（粘液性或实性，signet cell？）？） 阴性或阴性或unknown 下一步 7 组织标本类型组织标本类型 手术、活检标本：手术、活检标本： ffpe标本：推荐fish、rt-pcr、ihc 新鲜标本：推荐rt-pcr 细胞学标本：细胞学标本： 细胞沉渣（pellet）：rt-pcr 细胞蜡块（cell block）：推荐fish、rt-pcr、ihc 8 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egfr突变检测突变检测 腺癌（粘液性或实性，腺癌（粘液性或实性，signet cell？）？） 阴性或阴性或unknown 据组织类型选择合适技术 新

6、鲜标本石蜡标本 ventana ihc 手动手动ihc检测检测* ？ 阳性阳性 阴性阴性 fish rt-pcr 多重多重pcr或或race *: 对于部分无条件行ventana ihc检测的中心，手 动alk ihc可作为替代的筛选方法 : 如果是细胞学样本，推荐使用rt-pcr检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒 细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选 3+/2+/1+ alk融合基因阳性非小细胞肺癌融合基因阳性非小细胞肺癌 9 3-alk探针杂交端粒的断点大约是300 kb，并用橘色荧光标示。 5-alk探 针杂交着丝粒的断点大约是442 kb，并用绿色荧光标示。 vysis

7、 alk break apart fish probe kit. 06n38-020, 30-608495/r2 10 橘红色与绿色探针相互橘红色与绿色探针相互 临近或粘合：临近或粘合：alk 阴性阴性 橘红色与绿色探针相互分离或橘红色与绿色探针相互分离或 单个橘红色探针：单个橘红色探针：alk阳性阳性 11 结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读 晚期患者小活检标本晚期患者小活检标本(2mm)，很难保证每个视野存在，很难保证每个视野存在50个癌个癌 细胞细胞 价格昂贵，价格昂贵，2600元左右元左右/例，无法适用于筛选例，无法适用

8、于筛选 目前，临床研究的结果均是以目前，临床研究的结果均是以fish为检测手段为检测手段 12 split-signal fish: fusion-signal fish: translocation-positive translocation-negativefalse-positive false-negative microscope: sample/nucleus: slide: 13 alk fish interpretaion criteria: 15% split signals, at least 50 tumor cells were analyzed, if the re

9、sult is equivocal, additional 50 tumor cells should be counted. positive cells: separated green and orange signals or single red signals identified cells with rearranged alk; negative cells: overlapping of orange and green signals (yellowish) indicated cells in which alk was not rearranged. martelli

10、 mp, sozzi g, hernandez l, et al. eml4-alk rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. am j pathol. 2009 feb;174(2):661-70 shaw at, yeap by, mino-kenudson m, et al. clinical features and outcome of patients with non- small-cell lung cancer who harbor eml4-alk. j clin onco

11、l 2009;27:424753. the assay should be only on 10% neutral buffered ffpe human lung tumor tissue. other types of specimens or fixatives should not be used. 14 cancer, 2012 crizotinib 临床疗效与临床疗效与alk+ 无关无关: -alk+% 分离率并非疗效就更好分离率并非疗效就更好 - alk+%分离率低并非疗效不好分离率低并非疗效不好 15 sun, jong-mu, et al.journal of thoraci

12、c oncology. 7(12):e36-e38 16 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egfr突变检测突变检测 腺癌（粘液性或实性，腺癌（粘液性或实性，signet cell？）？） 阴性或阴性或unknown 据组织类型选择合适技术 新鲜标本石蜡标本 ventana ihc 手动手动ihc检测检测* ？ 阳性阳性 阴性阴性 fish rt-pcr 多重多重pcr或或race *: 对于部分无条件行ventana ihc检测的中心，手 动alk ihc可作为替代的筛选方法 : 如果是细胞学样本，推荐使用rt-pcr检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒 细胞成分、不吸烟、年龄

13、60岁）中进行筛选 3+/2+/1+ alk融合基因阳性非小细胞肺癌融合基因阳性非小细胞肺癌 17 在 alk融合阴性的患者，免疫组化显示无 alk表达。 fish：进行vysis lsi alk双色打散fish探针 检测到alk融合（分裂的红色和绿色信号）。 /10.1155/2013/757490 对 amoydx eml4-alk融合基因检测，实时 rt-pcr显示delta rn对pcr循环数的变化。 在 alk融合阳性的患者，免疫组化显示alk 表达。 18 characteristicseml4-alk mutation, n (%)wild typ

14、e, n (%)p age, years 60 60 9 (3.6) 19 (7.9) 240 (96.4) 220 (92.1) 0.040 sex male female 9 (3.1) 19 (9.8) 286 (96.9) 174 (90.2) 0.002 stage ia ib iia iib iiia iiib iv 12 (9.0) 4 (2.9) 2 (33.3) 1 (2.3) 9 (5.5) 0 0 122 (91.0) 132 (97.1) 4 (66.7) 42 (97.7) 156 (94.5) 1 3 0.036b histopathology ad scc ad-

15、scce others 25 (7.2) 2 (2.0) 1 ( 5.6) 0 324 (92.8) 99 (98.0) 17 (94.4) 20 0.053d differentiation poor good unidentified 8 (6.3) 17 (5.0) 3 (12.5) 119 (93.7) 320 (95.0) 21 (87.5) 0.594 smoking status no yes unknown 21 (8.2) 4 (2.6) 3 (4.0) 236 (91.8) 152 (97.4) 72 (96.0) 0.021f probaility of disease-

16、free survival 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 6.018.012.0 24.0 time(months) logrank,p=0.006 alk positive alk negative j. x. zhou，et al. annals of oncology 00: 17, 2012 doi:10.1093/annonc/mds626 19 eml4-alk变异体的多种引物，变异体的多种引物，gapdh作为对照作为对照 glci内部数据：所有内部数据：所有12个个 alk融合阳性样品均通过多融合阳性样品均通过多 路路rt-pcr测序技术得以证实。测序技术得以证

17、实。 20 takeuchi et al. multiplex reverse transcription-pcr screening for eml4-alk fusion transcripts. clin cancer res 2008;14(20): 6618 zhang et al. molecular cancer 2010 融合序列捕获融合序列捕获 的确定性的确定性 21 xc zhang，yl wu et al. 2012 esmo， 22 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egfr突变检测突变检测 腺癌（粘液性或实性，腺癌（粘液性或实性，signet cell？）？） 阴

18、性或阴性或unknown 据组织类型选择合适技术 新鲜标本石蜡标本 ventana ihc 手动手动ihc检测检测* ？ 阳性阳性 阴性阴性 fish rt-pcr 多重多重pcr或或race *: 对于部分无条件行ventana ihc检测的中心，手 动alk ihc可作为替代的筛选方法 : 如果是细胞学样本，推荐使用rt-pcr检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒 细胞成分、不吸烟、年龄5%的肿瘤细胞呈现颗的肿瘤细胞呈现颗 粒状细胞质强着色；粒状细胞质强着色；ihc 2+：5%的肿瘤细胞呈现中度细胞的肿瘤细胞呈现中度细胞 质着色；质着色；ihc 1+：5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊

19、的细胞质的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质 着色或着色或5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；的肿瘤细胞有任何程度的着色；ihc 0：肿瘤细胞：肿瘤细胞 无着色。无着色。” e thunissen, et al. virchows arch(2012)461:245-257 31 yoshiko murakami, et al. frontiers in oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024 32 thunnissen e, et al. virchows arch . 2012;461:245257 33 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egf

20、r突变检测突变检测 腺癌（粘液性或实性，腺癌（粘液性或实性，signet cell？）？） 阴性或阴性或unknown 据组织类型选择合适技术 新鲜标本石蜡标本 ventana ihc 手动手动ihc检测检测* ？ 阳性阳性 阴性阴性 fish rt-pcr 多重多重pcr或或race *: 对于部分无条件行ventana ihc检测的中心，手 动alk ihc可作为替代的筛选方法 : 如果是细胞学样本，推荐使用rt-pcr检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒 细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选 3+/2+/1+ alk融合基因阳性非小细胞肺癌融合基因阳性非小细胞肺癌 34 a

21、lk融合蛋白融合蛋白: 无alk重排的nsclc不表达alk融合 蛋白 部分alk融合蛋白表达较低 ventana ihc的原理的原理: 使用具有高度敏感性和特异性的一 抗d5f3 全自动仪操作，充分保证特异性 独有optiview扩增技术，充分保证敏 感性 d5f3 rabbitt monoclonal antibody optiview dab ihc detection optiview amplification kit 35 35 全自动全自动ventana ihc：信号扩增：信号扩增 常规常规ihc：无信号扩增：无信号扩增 d5f3 rabbit mabcontrol rabbit

22、 mab alk-positive nsclc by vysis fish and ventana alk ihc 36 d5f3 rabbit mabcontrol rabbit mab alk-positive nsclc by vysis fish and ventana alk ihc d5f3 rabbit mabcontrol rabbit mab large majority of positive cases exhibit strong staining. 37 37 判读标准简单，仅存在阴性判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读阳性的判读 ihc 阳性阳性 = fish

23、 阳性阳性 ec minca, et al. j mol diag, 2013 38 ventana. 1011623en rev c.2012; ft0700-410f 临床解释临床解释染色说明染色说明 alk阳性阳性 肿瘤细胞细胞质中存在强颗粒状染色肿瘤细胞细胞质中存在强颗粒状染色 （任何阳性肿瘤细胞的百分比），（任何阳性肿瘤细胞的百分比），已已 知的假阳性染色要排除，包括：知的假阳性染色要排除，包括： 光镜下肺泡巨噬细胞胞质内斑点光镜下肺泡巨噬细胞胞质内斑点 神经源性细胞（神经和神经节细胞）神经源性细胞（神经和神经节细胞） 腺上皮细胞染色腺上皮细胞染色 腺上皮细胞胞内淋巴侵润腺上皮细胞胞

24、内淋巴侵润 nsclc患者的正常粘膜组织和坏死肿患者的正常粘膜组织和坏死肿 瘤组织有时也能见到染色颗粒（包括瘤组织有时也能见到染色颗粒（包括 粘液素），这些都应该排除在外粘液素），这些都应该排除在外 alk阴性阴性肿瘤细胞细胞质中无强颗粒状染色肿瘤细胞细胞质中无强颗粒状染色 ihc 阳性阳性 =fish阳性阳性 ihc 阴性阴性 =fish阴性阴性 39 39 全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好 40 40 价格便宜，可同时用于价格便宜，可同时用于alk的筛选和诊断的筛选和诊断 emea（欧盟）批准（欧盟）批准 ventana ihc用于诊

25、断用于诊断 alk阳性阳性nsclc，从而，从而 帮助确定可使用克唑替帮助确定可使用克唑替 尼的患者尼的患者 中国患者检测价格中国患者检测价格 预估预估250元元/例例 41 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egfr突变检测突变检测 阴性或阴性或unkown 是否必须在富集是否必须在富集 人群中检测人群中检测alk ？ 下一步 42 egfr与与alk双突变的存在：双突变的存在：5%-8% eurtac研究中：双突变概率研究中：双突变概率15.8%（rt-pcr法）法） 有文献报道，双突变患者克唑替尼治疗有效有文献报道，双突变患者克唑替尼治疗有效 43 如果按照临床因素富集，将漏诊如果按

26、照临床因素富集，将漏诊33%（2/6）的的alk阳性患者阳性患者 yoshiko murakami, et al. frontiers in oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024 44 如按病理因素富集：可能会遗漏如按病理因素富集：可能会遗漏30%(5/17)的的alk阳性患者阳性患者 45 nsclc 活检组织标本活检组织标本 egfr突变检测突变检测 阴性或阴性或unknown 据组织类型选择合适技术 新鲜标本石蜡标本 ventana ihc 手动手动ihc检测检测* 阳性阳性 阴性阴性 fish rt-pcr 多重多重pcr或或race *: 对于部分无条件行ventana ihc检测的中心，手 动alk ihc可作为替代的筛选方法 : 如果是细胞学样本，推荐使用rt-pcr检测 虚线：建议优先在富集人群（粘液性腺癌、含 印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛 选。 3+/2+/1+ alk融合基因阳性非小细