麻风树生物柴油研究和开发进展

1、麻风树生物柴油研究和开发进展麻风树生物柴油研究和开发进展陈放徐莺唐琳王胜华吴军(四川大学生命科学学院,四川大学生物能源研究所,四川大学国际麻风树研究中心,成都,610064)作者简介陈放,四川大学生命科学学院院长,教授,博士生导师,生物能源研究所所长;中国可再生能源学会理事及生物质能专委会副主任,中国植物学会常务理事;主要从事能源植物及生物技术的研究与开发.近几年来共主持承担了国家自然科学基金,国家科技支撑计划等国家及部省重大重点科研课题与国际合作项目10r项,主要涉及麻风树等能源植物资源评价与育种技术,分子生物学,基因技术及生物柴油与综合利用的关键技术研发等领域.参考文献xiaoboqin,

2、xiaojiangzheng,caixiashao.eta1stress-inducedchrcinlpromoterinleavesofjatrophaciifc,slandcharacterizationintransgenictobaccoplanta,2009101007/s0042500909569参考文献gaos.chenf.ef_fectsofsaltstressongrowth.a13tioxidantenzymeandphenylalan1neammonialyaseactivitiesinjatrophacuicaslseedlingsplantsoi1environ,20

3、08f91:37438l参考文献yanghe,vijayapasapula,xiangli,etalagrobacteriumtumefaciensmediatedtransformationofatrophacurcas:factorsaffectingtransienttransformationefficiencyandmorphologyanalysisoftransgeniccallisilvaegenetica200958r31:123.12854随着世界能源消耗量的不断剧增,生态环境恶化加剧,能源安全与环境问题正在越来越深刻地影响着当今全球社会和经济的可持续发展.寻求发展生物能源

4、等可再生能源或新能源来解决目前和未来的能源与环境问题已成为国际上备受关注的热点,不少国家正在或已制定有关生物能源的发展战略.当前正在持续的国际金融危机对新能源产业的发展带来新的挑战与新的机遇.作为能源消耗大国的中国也正面临日趋严峻的能源与环境问题.近年来我国政府高度重视可再生能源与新能源的发展,已将其确定为国家产业发展的重点方向.大力发展生物能源是符合国情的战略选择.麻风树(jatropha.chfcasl.),又名小桐子,主要分布于热带和亚热带地区,主要生长在美洲和亚洲热带地区.在我国栽培或半野生于南方热带和亚热带地区,分布面积较广,资源较丰富(参见图1,图2).近年来发现该种植物在工业用油

5、,生物化工,生物农药,新药开发等方面有着生物产业技术i2009.05,.1潜在价值,麻风树是目前公认的最适宜开发的生物柴油树种,并且又是干热河谷等地区造林绿化的优良树种,因此具有广泛的利用前景.麻风树的生态分布广泛,从干热的亚热带到潮湿的热带雨林都有其分布,它可以在年降雨量2001200mm,年平均气温1828.5.c的环境下生存.麻风树常生于海拔500-1600m的平地,丘陵坡地及河谷荒山坡地,常栽培于园边作绿篱,也有一些为半野生状态.麻风树喜光,喜暖热气候,耐干旱瘠薄已在不少国家栽培.本文主要介绍有关四川大学麻风树生物柴油研究与开发的进展情况.1麻

6、风树种质资源研究和优良麻风树类型选育开展对现有麻风树资源的筛选,评价研究,是培育麻风树生物柴油专用品种必不可缺的工作,也是较快获得具有栽培价值的优良麻风树类型的方法.在从印度尼西亚,缅甸,柬埔寨,印度,马来西亚,巴西,马达加斯加,马里等因睡管一唱一翌国家和我国四川,云南,广西,广东,品(o.819.46)中最低.海南等地区收集上千份麻风树材料的基础上,研究人员着重对其种子含油量和植株抗逆性等方面进行了研究.对麻风树种子及种子油性质的相关数据进行方差分析,结果表明,产地不同,麻风树种子的生物学性质,种子油理化性质和脂肪酸组成都存在一些差异.以我国西南6个地区采集的麻风树种子为例,所有样品的百粒重

7、范围为41.8071.39g,出仁率为60.02%81.43%,种仁含油率为51.76%57.93%,种子含油率为31.07%47.17%,不饱和脂肪酸含量为74.89%79.68%.在种子含油量方面,以云南永胜产麻风树的种子最高,其出仁率为81.43%,种仁含油率为57.93%,种子含油率为47.17%,不饱和脂肪酸含量为79.68%.攀枝花和宁南产麻风树的种子次之.在酸值方面,云南双柏和贵州罗句麻风树的种子油酸值为0.81,在所有样笔者研究团队与公司合作首次开发了麻风树种子含油量快速微量无损伤检测方法及设备.在进行麻风树种子含油量和水分测定时,可利用低场核磁共振分析仪进行麻风树种子含油量的

8、快速微量测定方法简单,结果可靠,对种子无损伤检测出的高含油量种子可直接用于育种试验.在耐低温种质资源的筛选过程中发现,三个不同产地(四川攀枝花,云南红河和永胜)的麻风树用8c的低温胁迫处理后,所受到的伤害(叶绿素含量减少,根系活力降低,生物膜通透性增大等指标j以云南永胜的最低,四川攀枝花的次之,云南红河的最高,并且这种影响与资源所在地的气温呈负相关关系,这提示在年均气温较低地区可能容易发现耐寒性强的优良单株.为了确定上述变异与环境和遗传l璧竺鉴兰垦参考文献王云霄,张颖,江璐玎等.麻风树水通道蛋白新基因尼p旰旱胁迫下的功能分析.热带亚热带植物,2008,16(4):289-295.参考文献罗孟军

9、,陈放,颜钫等.麻风树核糖体失活蛋13eurein在大肠杆菌中高效表达条件自研究中国中药杂志,2009,34【6):656-659参考文献秦小波.麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析植物生理学通讯,2008,44(5):891896参考文献毛俊娟,倪婷,王胜华等.干旱胁迫下外源钙对麻风树相关生理指标的影响四川2008,450):669-673参考文献张正银,刘波洋,陈放等.麻风树aflp体系的建立与优化.应用与环境生物,2009,15(2):280283.参考文献张富丽,蔡峰,吴军等.转麻风树甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草耐盐性中国农业科学,2008,41(12):40304038wvcw.bi

10、i2009.05(9月).1生物产业技术55参考文献郭亮,卿人韦,何玮等麻风树叶绿体克隆和鉴定应用与环境生物,2008,14(4):469474参考文献罗绍银,高继海,叶生亮等一种提取富含油脂植物组织总rna的改良sds酸酚法.应用与环境生物,2009,15r2:284287.参考文献林莎,罗绍银,林颖等从麻风树胚乳中提取总rna的快速方法应用与环境生物,2008,14(5):692694参考文献刁明苏,徐莺,陈放.麻风树毒蛋白对小鼠器官的急性毒性研究.四jli大学(自然科学版),2008,45(4):967971参考文献林莎,高帆,罗洪等麻风jctctpl基

11、因的同源性分析及时空表达模式鉴定中国生物化学与分子生物,2008,24(8):727.734参考文献户静惠,吴军,肖科等麻疯树花的形态结构与传粉关系研究四川大学(自然科学版),2008,45(4):1485-1488.参考文献江璐玎,王云霄,王迎春等.麻风树酰基载体蛋白的基因克隆,表达分析及原核表达应用与环境生物,2008,14(6):769773因素之间的关系,进一步开展分子标记研究是非常必要的.从麻风树9个自然居群135个样品的issr分子标记研究结果来看,自然界的麻风树具有丰富的遗传多样性水平(多态百分率ppb=97.04%,neis遗传多样性h=0.2357.shannon信息指数/=

12、0.3760)特别是群间遗传多样性较大(qt=0.5398),高于居群内数据.后者水平较低可能与麻风树扦插,近交占主导的繁育方式有关.现已初步筛选出含油量高或抗逆性强的优良单株130余株.其中种仁含油量超过65%且生长快速的有120余株,耐寒单株7株,抗虫单株5株.建立了高产优质麻风树实生苗和扦插苗种植技术和高含油麻风树品种选育技术,规模化育苗可达30000株/亩:在规范化人工栽培的条件下.每亩可产麻风树种子300500kg,可加工生物柴油140180kg;通过单株系统选育,筛选出了高含油率的麻风树新品种csc6,其种仁平均含油量达63%,已获得四川省品种认定证书(川rscjc一0022005

13、)参考文献2现代生物技术在麻风树生物淳三要柴油专用品种培育中的应用rna的提取方法生物化学与生物物理进,.,仆,.hhh.几展,2008,35(5):591?597参考文献吴军,王胜华,陈放麻风树油脂含量遗传性与csc高油63品种的选育种子,2008,27(5):100102参考文献ryansgao,wyang,eta1.nickeltoxicityinducedantioxidantenzymeanddhenvla1anineammonialyaseactivitiesinjaophacuicaslcotyledons.plantso1lenviron,200854,(7):29430056

14、将现代生物技术应用于麻风树优良品种(参见图3)的培育,是目前研究的重点方向主要包括组织培养技术和分子育种技术两方面.以麻风树花药和胚乳为外植体诱导愈伤组织并进一步分化成植株已经取得成功,可以缩短麻风树育种周期,可用于耐寒,耐盐碱等麻风树品种的培育.分子标记的结果提示基因遗传因生物产业技术l2009.05(9b).1素在麻风树相关性状的决定中具有重要作用,因此了解相关过程的分子基础,发现其中的关键控制基因.对于利用现代育种技术培育麻风树优良品种具有重要的意义,笔者研究团队着重开展了以下工作:麻风树胚乳cdna文库的建立及规模测序工作:克隆鉴定参与麻风树油

15、脂合成代谢的基因:克隆鉴定参与麻风树逆境应答的基因;克隆参与麻风树性别分化与花发育的基因.现已克隆和鉴定了多个与麻风树油脂合成及抗逆性等相关的基因,如麻风树叶绿体o93脂肪酸脱饱和酶基因麻风树甜菜碱醛脱氢酶基因(jcbd1),麻风树干旱胁迫相关的水通道蛋白基因(jcpip2),麻风树干旱诱导差异表达基因(jcmips),麻风树硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因,麻风树雌性相关基因(jcfdo03)麻风树毒蛋白(curcin)基因等,为利用基因工程技术筛选和培育麻风树优良品种奠定了基础.3良种快繁技术当前的麻风树生产中,主要利用实生苗进行繁殖.研究显示,即使这些实生苗来自于同一母株,子代植株之间,

16、子代与母株之间含油率仍有显着差异;与之相反,扦插苗较好地保持了母株的含油率.这一结果表明,就含油量可控性方面来说,无性繁殖方式优于实生苗繁殖,从而建立了高效低成本的麻风树无性快繁技术体系.在利用麻风树腋芽进行繁殖时发现,kt(激动素)2,4一d(2,4一二氯苯氧乙酸)的激素搭配适于诱导愈伤组织,促进腋芽增殖需要在培养基ms+i.0mg/lba+0.01mg/liba+5.0mg/lagno3上进行,ph值的变化对腋芽分枝的影响不大,奄厂风柴丽究币口开发进屣采用瞬时高浓度生长素刺激或者无激素的活性炭培养基都能得到92%以上的生根率.4麻风树栽培技术研究栽培技术是影响麻风树原料产量的另一重要因素.

17、当前的研究主要集中在各种胁迫条件对麻风树种子萌发,幼苗发育以及光合作用效率的影响等方面以及采摘时间和储存时间对麻风树种子油的脂肪酸含量和组成的影响等.4.1种子萌发特性研究研究显示温度对种子的储存和萌发有显着影响.30.c时最有利于种子萌发.剥壳种子发芽率显着高于未剥壳种子,光照对种子萌发没有明显作用,播种过深会抑制种子萌发,实际生产中适于浅播.储存温度同样明显影响种子发芽率.用不同的温度(】5.c,4.c,一20.c,一80.c)储存麻风树种子,在一个月和三个月取出种子测定其发芽率,脂质过氧化程度,抗氧化物酶活性的变化以及苯丙氨酸解氨酶活性的变化.随着储存温度下降,麻风树种子过氧化程度显着提

18、高,而丙二醛含量升高,超氧化物歧化酶活性在4.c和一20.c比较低,在常温和一80.c有所升高.超氧化物歧化酶在1个月变化不大,在3个月时候随着温度下降而出现明显的上升趋势:过氧化氢酶活性与温度表现出明显的正相关.苯丙氨酸解氨酶活性在1个月和3个月都没有太大变化.sod,pod和cat在麻风树种子低温储存的抗冻和清除活性氧簇方面都起到了关键作用.4.2光合生理特性研究麻风树叶片净光合速率日变化青果期浅黄色0.6669.2l1331黄果期浅黄色0.5459o21478新采果实亮黄色o3615l5664储存1年果实黄褐色02429255.56储存2年果实黄褐色0l95.6954.74及其与环境因子

19、相互关系的试验结果表明麻风树净光合速率日变化呈双峰曲线,净光合速率最大值为14.4gmolco,?1ti?s,光补偿点为45pmo1co,?1ti.?s,光合主峰出现在11:00次峰出现在15:30,光合主峰有一个长达4.5h的高效光合平台期(9.814.4pmolco,?m?s),是一天中最重要的产物积累时期.净光合速率日变化曲线表明麻风树光合午休现象明显且气孔限制是产生午休的主要原因.麻风树光能利用率较高.最大值为3.52%.研究显示麻风树的光补偿点和光饱和点较高,为耐干旱植物.在高温高辐射时能有效的通过降低气孔导度来限制蒸腾作用.4.3逆境生理研究以攀西地区麻风树为材料,采用溶液培养实验

20、方法.ph值4.1,设置不同温度(24.c,29.c,34)研究不同铝离子处理浓度(a1浓度:0,0.olmmol/l,0.1rnmol/l,1mmol/l,5mmol/l)对三月龄麻风树幼苗根系活力,叶片丙二醛(mda)含量,叶片脯氨酸(pro)含量,过氧化物酶(pod)活性等生理指标的影响.结果表明:相同a1浓度下,随温度升高,根系活力降低,mda,pro含量增加,pod活性增加.34.c时随着al浓度增加.根系活力降低,mda,pro含量增加,pod活性增参考文献zhangy,wangy,jiangl,etalaquaporinjcplp2isinvolvedindroughtrespo

21、nsesinjatrophacrcaactabiochimicaetbiophysicasinica,2008,39(10):785794参考文献wei0in,luweida,liaoyi,etalplantregenerationfromepicotylexplantofjatrophacrcasjplantphysiolmolbiol,2004,30(4):475478参考文献黄明星,魏琴,徐莺等麻风树逆魔蛋白curcin2基因在烟草中的表达中国生物工程杂志,2008,27(4):94-98参考文献luotong,pengshuming,dengwuyuan.cta1.characterl

22、zati0nofanewstearoylacylcarrierproteindesaturasegenefromjaophacufcsbiotechn0l0gyletters,2006.28:657662i2009.05(9)1).i生物产业技术57一sas0l_(oxl三焉堕le黧一一肌一yg唱_三li蓉一一en擘.一船炯川吣鏊一坟不于茸翻杯手u时r称准足麻jxl树-i=韧柴涠判足技术指标值实际技术指标值(gb/-i-20828-2007)90%回收温度/c不高于360345合格硫含量(质量分数)/%不大于0.05oo2合格10%蒸余物残碳(质量分

23、数),%不大干o3o018合格硫酸盐灰分(质量分数)/%不大于002000041合格水分(体积分数)/%不大于无运动黏度(40.c)/(mm/s)1.96.04.429合格铜片腐蚀(5c3h)/级不大于11合格机械杂质无无合格冷凝点/口c不高于报告o闭口闪点,c不低于13o162合格十六烷指数不小于47密度(20.c)/(kg/m3)820900876.2合格酸值/(mgkoh/g)不大于o80012合格参考文献beiniu,huaxunye,yingxu,etalcloningandcharacterizationofanoveld12.fattyaciddesaturasegcaefrom

24、thetreesapiumsebiferum.biotechno1lett,2007,29(6):959964.0参考文献zhouh,luh,liangbsolubilityofmulticomponentsystemsinthebiodieselproductionbytransesterificationofjatrophacueca$l.oilwithmethanoljchemicalandengineeringdata,2006,51(3):1130-1135.参考文献qwei,yliao,ychen,etalisolation,characterisationandantifunga

25、lactivityof卢一1,3-glucanasefromseedsofjatrophacurcasjournalofbotany,2005,7l(1):959958加.适度低温适量浓度的ap(29.c:0.01mmol/la13,24.c:0.01mmol/lai,0.1mmol/la)处理下.根系活力增强mda和pro含量降低,pod活性降低.1mrnol/l以上al处理下,2434.c温度下的麻风树都受到不同程度的伤害.29.c,ph值4.,al3+浓度lrmnol/l处理下,外源钙的加入增强了根系活力,降低了叶片mda,pro含量和pod活性,改善了酸铝胁迫对麻风树的影响.4.4采收

26、果实含油率研究利用gcms分析青果期,黄果期,黑果期及储存1年,2年麻风树种子油,5个油样的水分酸值,出油率等指标有较大差异其他主要化学成分碘值皂化值差异不大.未成熟青果的出油率为13.13%,水分为0.66%,酸值为69.21,不饱和脂肪酸含量最低.新采成熟果实的出油率为54.64%,水分为0.36%酸值为1.51,不饱和脂肪酸含量也相对较高.因此,新采的成熟果生物产业技术i2009.05(9月).1实较为适合作生物柴油的原料.4.5栽培技术示范在上述工作的基础上,中国-undp绿色减贫项目的支持下结合四川,云南,贵州和海南的生产实践经验,出版了小桐

27、子生产技术(四川大学出版社,2007)一书.专门适用于农户的小桐子生产技术手册也已经印制散发在云南(元阳,双柏),四川(会理,盐源),贵州(贞丰,罗甸)和海南(乐东,临高)等地开展技术培训1000余人次.结合承担的国家科技项目和国际合作项目,笔者研究团队已在四川凉山州会理县和盐源县,广西百色市,广东梅外市和海南等地以及印度尼西亚,缅旬,巴西等国建立了麻风树规范栽培示范基地.四川大学同中国海洋石油公司等有关公司合作在海南等地建立了麻风树示范种植基地还同有关研究机构与公司合作建立了国际麻风树研究中心.5麻风树生物柴油开发和绿色生产工艺研究由于麻风树油的酸值一般为lo15mgkoh/g.游离脂肪酸较

28、高,经过预酯化处理使原油酸值降低到5以下.主要对预酯化反应条件进行了优选,发现反应温度对化学反应速率有明显影响.在通过两次酯交换反应后,得到生物柴油酸值(mgkoh/g)低于0.6,收率96%以上.与公司合作开发了麻风树生物柴油bio,b20,b30,bio0等系列产品,建立了产品质量标准,并进行了初步的车载运行试验,相关的技术性能通过了有关部门的检验,在燃油性能(如闪点,凝固点,题管一x叭m一蒌蒌篡厂两互蔡面螽翻开发进展十六烷值,硫含量,热值,运动黏度等)多项指标均优于国产石化柴油标准与国家生物柴油标准.建立了年产5000吨麻风树生物柴油中试基地.在此基础上,对其放大的生产工艺和技术进行了系

29、统研究,建立了万吨级的麻风树生物柴油一体化联产示范装置,进而提高了综合利用效益.生物催化剂是生物柴油转酯反应研究中重要的研究对象.目前新酶种的发现和全细胞催化剂的开发是这个领域中的研究热点.为此笔者研究了麻风树油脂代谢的重要代谢酶脂肪酶,通过粉状毕赤酵母表达系统初步开发了该酶的全细胞催化剂.并且研究了该催化剂对麻风树油脂的催化效率.比较了全细胞催化剂和不同公司的固定化脂肪酶对麻风树油脂和大豆油脂的作用效果,结果表明麻风树油脂中油酸甲酯和亚油酸甲酯含量相当且较多,而棕榈酸甲酯和亚麻酸甲酯略少.麻风树脂酶全细胞催化剂对麻风树油脂的催化能力要比对大豆油的强.6麻风树的综合利用开展麻风树综合利用研究,

30、对于提高麻风树生物柴油产业综合效益具有非常重要的意义.当前的利用主要集中在甘油衍生物,活性炭,饲料和肥料,生物杀虫剂,生物医药产品等方面(参见图4).6.1麻风树抗病毒,真菌成分的研发笔者研究团队首次从麻风树叶中提取了以麻风树萜醇为主要成分的混合物,发现其具有抗炎,抗菌和抗病毒作用,能有效杀灭包括金黄色葡萄球菌,白色念珠菌和黑曲霉菌在内的多种病原菌以及疱疹病毒等.并开发了用于皮肤细菌,真菌与病毒感染防治的产品.参考文献mingxinghuang,peihou,qinwei,eta1aribosoraeinactivatingprotein(curcin2,inducedfromjatropha

31、ollrcasreduceviralandfungalinfectionintransgenictobaccoplantgrowthregulation,2008,54(2):115-123参考文献linjuan,yanfang,tanglin,etalantitumoreffectsofcurcinfromseedsofjatrophacufcasartapharmacolsin,2003,24(3):241246参考文献weiqin,huangmingxing,xuying,etalexpressionofaribosomeinactivatingproteinfcurcin2injatr

32、ophacisinducedbystressjbiosci,2005,30(3):351-357参考文献juanlin,tun-xianglixuanweizhou.etalcloningandcharacter1zatj0nofacurcingeneencodingaribosomeinactivatingproteinfromjatrophacurcasdnasequence,2003,14(4):311317参考文献linjuan,chenyu,xuying,etalclongandexpressionofcurcin,aribosomeinactivatingproteinfromth

33、eseedsofjatrophacurcasaetabotancasinica.2003,45(7)858863.参考文献mengjunluo,xinyuyang,weixinliu,etalexpression,purificationandantittllnoractivityofcurcinactabiochimicaetbiophysicasinica,2006,38(9):663669biotechno1.2006.7l:222227www.i2009.05(9月).【生物产业技术596.2麻风树毒蛋白研究麻风树毒蛋白是一种一型植物核糖体失活蛋白,它对正常细胞毒性极小,却能特异性地抑制包括肿瘤细胞和植物病原菌(水稻稻瘟病菌,