高效液相色谱法及超临界流体色谱法

1、现代分析技术现代分析技术现代分析技术现代分析技术现代分析技术现代分析技术 第十章第十章 第十章第十章第十章第十章第十章第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法高效液相色谱法及超临界流体色谱法 10.1 概述概述 10.2 高效液相色谱法的基本原理高效液相色谱法的基本原理 10.3 高效液相色谱法的类型高效液相色谱法的类型 10.4 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 10.5 超临界流体色谱法超临界流体色谱法 10.6 实验技术实验技术 2 10.110.110.1 概述概

2、述概述概述概述概述 hplc high velocity, high resolution and high sensitivity high-performance liquid chromatography high-pressure liquid chromatography high-price liquid chromatography 3 4 5 10.2 10.2 10.2 hplchplchplc的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理 gc的基本理论、基本概念适用于的基本理论、基本概念适用于hplc。液相色谱的液相色谱的van deemter方程方程 6

3、力相：滞留的流动相传质阻相；流动的流动相传质阻力： ：固定相的传质阻力项略；纵向扩散项很小，可忽 m psm m pm s fs m m psm m pm s fs m d d d d d d u d u d d d d d d u d dh 22 2 222 p 2 2 2 : 涡流扩散项涡流扩散项 纵向扩散项纵向扩散项 传质阻抗项传质阻抗项 板高板高h越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面 综合考虑，综合考虑， 提高提高提高提高提高提高hplchplchplc的柱效的措施的柱效的措施的柱效的措施的柱效的措施的柱效的措施的

4、柱效的措施 采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀； 采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度； 流动相采用小分子溶剂，减小粘度流动相采用小分子溶剂，减小粘度( h2o、acn、meoh) ； 适当提高柱温，增大适当提高柱温，增大dm； 采用一定的流动相流速采用一定的流动相流速u(一般一般1 ml/min) 7 u d d d d d d u d dh m psm m pm s fs m 222 p 2 2 柱外效应柱外效应：柱前峰展宽柱后峰展宽：柱前峰展宽柱后峰展宽 柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前峰展宽进样及进样

5、器到色谱柱连接管引起 柱前后展宽检测器流通池和连接管引起柱前后展宽检测器流通池和连接管引起 10.3 hplc10.3 hplc10.3 hplc的类型的类型的类型的类型的类型的类型 i i i 液液分配色谱法液液分配色谱法液液分配色谱法液液分配色谱法液液分配色谱法液液分配色谱法 liquidliquidliquid liquid partition chromatography, llpcliquid partition chromatography, llpcliquid partition chromatography, llpc 固定相与流动相均为液体(互不相溶)； 基本原理：组分在固

6、定相和流动相上的不同分配而实现分离； 固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；化学键合固定相：将 各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 8 （1 1）寿命长寿命长，固定液不易流失，柱稳定性高； （2 2）传质快传质快，表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （4 4）选择性好选择性好，可键合不同基团改变其选择性； （5 5）耐受各种溶剂，）耐受各种溶剂，有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱； 流动相类别流动相类别流动相类别流动相类别流动相类别流动相类别 流动相按极性分： 极性(乙腈、甲醇、水)； 弱极性(氯仿、乙酸乙酯)； 非极性(己烷)； 9 正相色谱法 反向色

7、谱法 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以 灵活调节流动相的极性或增加选择性，以 改进分离或调整出峰时间。 ii ii ii 液固吸附色谱法液固吸附色谱法液固吸附色谱法液固吸附色谱法液固吸附色谱法液固吸附色谱法 liquid solid absorption chromatography, lsac liquid solid absorption chromatography, lsac liquid solid absorption chromatography, lsac 1 0 固定相：固体吸附剂（硅胶） 基本原理基本原理：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离； 样品分子(x)被流

8、动相带入柱内，与流动相分子(s)在吸附剂的表面 发生竞争性的吸附作用. a m m a s n x s n x mobileabsorbantabsorbantmobile cc cc knsxnsx 吸附平衡常数 k 越大，保留值越大。 lasc中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂， 己烷乙酸乙酯；己烷氯仿 iii iii iii 离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法 ion exchange chromatography, iecion exchange chromatography, iecion exchange chromatogra

9、phy, iec k 越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强； 分析对象：离子分析对象：离子( (各种无机阴阳离子各种无机阴阳离子) )：so42+、no3 、 、cl 、 、na 、 、mg 等 等 有机酸碱、氨基酸有机酸碱、氨基酸 11 固定相：离子交换树脂 (聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂) 流动相：含有反离子的水溶液 (柠檬酸根离子、co3、f) 基本原理基本原理：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离； yrx xry kxryyrx rym rmy krmyrym xy k my k

10、xy my 12 13 iv iv iv 离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法离子对色谱法 ion pair chromatography, ipcion pair chromatography, ipcion pair chromatography, ipc 固定相：固定相：c18/c8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂的离子对试剂 流动相流动相：有机溶剂：有机溶剂 (甲醇甲醇/乙腈水乙腈水)加入离子对试剂加入离子对试剂 离子对试剂离子对试剂： 烷基铵类：烷基铵类：(c4h9)4n+oh- 、c16h33(c

11、h3)3 n+oh- (分析分析x ) 烷基磺酸类烷基磺酸类 ：己烷磺酸钠己烷磺酸钠c6h13so3na (分析分析x ) 基本原理基本原理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离。 14 生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后。 分析对象：有机酸、有机碱等分析对象：有机酸、有机碱等 column： ionpac ns1、ng1 eluent ： 2 mm tbaoh, 24% 48% acn in 10 min flow rate： 1.0 ml/min detection

12、： conductivity (suppressor type) regenerator：10 mn h2so4 1. methanesulfonic acid 5.0 g/ml (ppm) 2. 1-propanesulfonic acid 8.6 3. 1-butanesulfonic acid 8.7 4. 1-hexanesulfonic acid 8.8 5. 1-heptanesulfonic acid 8.9 6. 1-octanesulfonic acid 8.9 7. 1-decanesulfonic acid 9.1 0 retention time (min) 12168

13、 s 0.0 4 1 6 2 3 45 7 8.0 v v v 离子色谱法离子色谱法离子色谱法离子色谱法离子色谱法离子色谱法 ion chromatography, icion chromatography, icion chromatography, ic 固定相固定相：离子交换树脂：离子交换树脂 流动相流动相：电解质溶液（高电导）：电解质溶液（高电导） 分离原理分离原理：同：同iec，离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测 特点特点：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变：抑制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变

14、成低电导成分降低背景干扰。成低电导成分降低背景干扰。 16 分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等 抑制器的作用抑制器的作用 废液 back ground： na2co3 / nahco3 (700s) naf,nacl,nano3 na2hpo4,na2so4 retention time conductivity nafnaclnano3 na2hpo4 na2so4 back ground： na2co3 / nahco3 (700s) retention time conductivity hf hcl hno3 h3po4 h2so4

15、 retention time back ground： h2co3 (15s) conductivity 17 抑制器 w 安装在安装在电导电导池之前池之前 w 提高待提高待测测离子的离子的电导电导率率： ： w 降低背景降低背景电导电导 (淋洗液淋洗液) : na+,oh- h2o 18 y+ na+ 抑制器的工作原理抑制器的工作原理 ( (阴离子阴离子) ) x x- -: : 样品中的阴离子 y y+ +: : 样品中的阳离子 h2o h2o oh na+ y+ h2o na+ y+ x- na+ co32- (样品, 淋洗液) h+ h+ + co32- h+ + x- 至检测器 h

16、2co3 h+x- h2o h2 + oh h2ona+oh , h2 h2o , o2 废液 废液 电电极极 （）（） 电电极极 （）（） 纯水或来自检 测器的流体 h+ h+ h+h+ 阳离子交换膜 阳离子交换膜 19 h2o h2o h2o h2 + oh h2o 废液 / 气体 废液 h2o so42- y+ x- h+ msa- (样样品品e, 淋洗液）淋洗液） oh oh msa- so42- x- oh msa- so42- x- h+ msa- , o2 h2o, h2 h+ + oh- y+ + oh- h+ 抑制器的工作原理抑制器的工作原理 ( (阳离子阳离子) ) 至检测

17、器 h2o y+oh- x x- -: : 样品中的阴离子 y y+ +: : 样品中的阳离子 电电极极 （）（） 电电极极 （）（） 阴离子交换膜 阴离子交换膜 纯水或来自检测 器的液体 20 20 vi vi vi 空间排阻色谱法空间排阻色谱法空间排阻色谱法空间排阻色谱法空间排阻色谱法空间排阻色谱法 size exclusion chromatography, secsize exclusion chromatography, secsize exclusion chromatography, sec 22 固定相固定相：多孔性凝胶：多孔性凝胶 流动相流动相：水溶液或有机溶液：水溶液或有机

18、溶液 分离原理分离原理： 分离组分的分子尺寸分离组分的分子尺寸 凝胶的孔径大小凝胶的孔径大小 (葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶) 动画动画 特点特点： 体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积大的分子完全被排阻洗脱下来 体积小的分子最后的被洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来 分析对象分析对象： 高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）高聚物，生物大分子（蛋白、核酸） vii vii vii 亲和色谱法亲和色谱法亲和色谱法亲和色谱法亲和色谱法亲和色谱法 affinity chromatography, acaffinity chromatography, acaffinity chromato

19、graphy, ac 固定相固定相：固定相表面键合特异性配基：固定相表面键合特异性配基 流动相流动相：类似：类似llpc（乙腈/甲醇、水等） 分离原理分离原理：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离 分离过程：一般流动相携带试样分离过程：一般流动相携带试样 亲和物与配基结合亲和物与配基结合 强洗脱能力的流动相强洗脱能力的流动相 洗脱亲和物（大分子）洗脱亲和物（大分子） 23 分离对象：分离对象： 酶与基质（或抑制剂）酶与基质（或抑制剂） 抗原与抗体抗原与抗体 激素与受体激素与受体 外源凝集素与核酸的碱基对外源凝集素与核酸的碱基对 10.4 10.4 10.4 高

20、效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪 24 仪器特点：仪器特点：高压、高效、高速高压、高效、高速 分离对象分离对象：生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物 工作过程：工作过程： 高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统 核心部件：核心部件：高压泵高压泵 压力范围：压力范围：30 50 kpa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（7不够不够 灵敏。灵敏。 33 原理原理：利用待测物流入反应池时在工作电

21、利用待测物流入反应池时在工作电 极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流 通过，电流大小与待测物质浓度成正比。通过，电流大小与待测物质浓度成正比。 要点：要点： 具有电活性物质具有电活性物质 示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器 differential refractive index detectordifferential refractive index detectordifferential refractive index detector 原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出

22、来时，会引 起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 要点：灵敏度低，不能用于梯度洗脱 34 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 evaporative light-scattering detector, elsdevaporative light-scattering detector, elsdevaporative light-scattering detector, elsd 35 流出液流出液雾化器雾化雾化器雾化加热漂移加热漂移 管加热管加热溶剂蒸发溶剂蒸发激光束照在激光束照在 溶质颗粒溶质颗粒产生光散射产

23、生光散射 散射光强只与溶质颗粒大小和数散射光强只与溶质颗粒大小和数 量有关。量有关。 要点：通用型质量检测器， 可用于梯度洗脱 分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测 10.5 10.5 10.5 超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体色谱 supercritical fluid chromatography, sfcsupercritical fluid chromatography, sfcsupercritical fluid chromatography, sfc 36 定义定义： 以超临界流体为流动相的色谱分析法，具有以超

24、临界流体为流动相的色谱分析法，具有gc和和hplc的优点，的优点， 适于分析适于分析gc不能分析的高沸点、低挥发性的试样。不能分析的高沸点、低挥发性的试样。 超临界流体超临界流体： 在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介 于液体和气体之间。于液体和气体之间。 超临界流体既不是气体，也不是超临界流体既不是气体，也不是 液体，而是一种介于二者之间的液体，而是一种介于二者之间的 一种对分离很有利的流体。一种对分离很有利的流体。 超临界流体的特性超临界流体的特性超临界流体的特性超临界流体的特性超临界流体的特性超临界流体的特性 37 1 1）

25、性质介于液体和气体之间；性质介于液体和气体之间； 气体气体的的低黏度低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；，传质阻力小，可以快速高效的分离； 液体液体的的高密度高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质； sfc的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变改变 sfc的密度调节组分分离的密度调节组分分离， 超临界流体的密度与压力有关。超临界流体的密度与压力有关。 传质阻力小 适于低温 sfcsfcsfc的固定相和流动相的固定相和流动相的固定相和流动相的固定相和流动相的固定相和流动相的固定相和流动相

26、 38 sfc色谱柱色谱柱：填充柱填充柱 ：颗粒：颗粒dp: 310 m, lcol: 25 cm,固定液膜厚：固定液膜厚： 几几mm 交联毛细管柱交联毛细管柱：颗粒：颗粒 df: 0.05 1 m , lcol: 10 20 cm,固定液膜厚固定液膜厚0.05 1 m sfc的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物 要点：co2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解 性好，在紫外光区无吸收； 缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性； sfc的流动相的流动相： 超临界流体色谱仪器超临界流体色谱仪器超临界流体色谱仪器超临界

27、流体色谱仪器超临界流体色谱仪器超临界流体色谱仪器 39 与与hplc差别：差别： 1.hplc只在柱入口加压只在柱入口加压 ，而，而sfc整个都处于高整个都处于高 压下，使流动相处于高压下，使流动相处于高 密度状态；密度状态； 2.sfc必须装有毛细管限必须装有毛细管限 流器，以实现限流器两流器，以实现限流器两 端相的转变端相的转变 高压泵高压泵 无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算 机控制流动相的密度和流量； 检测器检测器 可采用hplc的检测器(uv, fl)，也可采用gc的fid检测器. sfcsfcsfc中的压力控制中的压力控制中的压力控制中的压力控制中的压力控制中的压

28、力控制 40 压力效应压力效应：在sfc中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密 度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 co2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变： 7.0 9.0106 pa，则：则： c16h34的保留时间：的保留时间： 25 5 min。 程序升压程序升压 sfcsfcsfc的应用的应用的应用的应用的应用的应用 i i i 聚苯醚低聚物的聚苯醚低聚物的sfc分析分析 色谱柱：毛细管柱 (10 cm 63 m i.d.) 固定相：键合二甲基聚硅氧烷； 流动相：co2 ； 柱温：120 c； 程序升压； sfc既可分析既可分析gc中不适用的中不适用

29、的高沸点、低挥发性样品高沸点、低挥发性样品和和hplc中缺少检中缺少检 测功能团的样品，它又比测功能团的样品，它又比hplc有更高的柱效和更快的分析速度。有更高的柱效和更快的分析速度。 分析对象分析对象：天然产物、高聚物、表面活性剂等。：天然产物、高聚物、表面活性剂等。 sfcsfcsfc的发展现状的发展现状的发展现状的发展现状的发展现状的发展现状 43 sfc的三次起落：的三次起落： 1.1960s的先驱性研究；的先驱性研究； 2.1980s初形成浪潮，认为会掀起初形成浪潮，认为会掀起 分析方法的革命；分析方法的革命； 3.目前，大公司纷纷撤去目前，大公司纷纷撤去sfc分离分离 设备，放弃进

30、一步发展的计划。设备，放弃进一步发展的计划。 缺点： a. 整个体系都要在高压下进行； b. 流动相的选择有限 (co2)； c. 仪器制造复杂，昂贵； g.guiochon (american lab 1998, (9), 1415)指出指出成功和普及并成为定 量分析方法必须具备： 易于使用，操作费用低， 能够得到准确，可重复的定量结果， 要能够解决至少一个分析化学中的重要问题. 如，1960s的gc用于石油和石化产品分析；1970s的hplc用于药 物、代谢物和生物化学品的分析。 超临界流体萃取超临界流体萃取超临界流体萃取超临界流体萃取超临界流体萃取超临界流体萃取 supercritica

31、l fluid extraction, sfesupercritical fluid extraction, sfesupercritical fluid extraction, sfe 44 超临界萃取超临界萃取：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差 别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。 超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且 表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度 大为提高。大为提高。 常用的超临界流体在常压下多为气